一種與雞腹脂沉積相關(guān)的miRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種與雞腹脂沉積相關(guān)的miRNA及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近二十年來(lái)，肉雞遺傳改良在體增重、生長(zhǎng)速度及飼料報(bào)酬等方面取得了較大的 進(jìn)展，但同時(shí)也伴隨著脂肪的過(guò)度沉積，特別是腹脂沉積?，F(xiàn)代商業(yè)肉雞品種每公斤體重就 包含150-200g的脂肪，這些脂肪中約80%并非生理需求，從而大大降低了飼料利用率。這 些多余的脂肪在屠宰時(shí)只能當(dāng)廢棄物丟棄，不但會(huì)直接影響肉產(chǎn)品的加工，而且還造成了 一定的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。脂肪的過(guò)度沉積已成為肉雞生產(chǎn)中所面臨的一個(gè)嚴(yán)峻問(wèn)題。 因此，低腹脂沉積一直是肉雞品系選育的重要目標(biāo)之一。
[0003] miRNA(MicroRNAs)是一類非編碼單鏈RNA分子，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡、腫瘤形 成等生理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。近年來(lái)的研究表明，miRNA是人類和動(dòng)物脂肪細(xì)胞 分化、脂肪沉積過(guò)程中所不可缺少的調(diào)節(jié)因子。如果可以獲得與主選性狀及其關(guān)鍵基因相 關(guān)的miRNA作為分子標(biāo)記，即可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的早期選擇，加快遺傳選擇進(jìn)展。
[0004] miRNA對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用是通過(guò)調(diào)控其特定靶基因來(lái)實(shí)現(xiàn)，僅僅借助 于生物信息軟件來(lái)預(yù)測(cè)靶基因，無(wú)疑將會(huì)是大海撈針。而通過(guò)某一特定時(shí)期、特定組織中 miRNA和mRNA同時(shí)深度測(cè)序分析，根據(jù)miRNA和mRNA呈負(fù)相關(guān)表達(dá)的原理，并結(jié)合靶基因 軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果，會(huì)大大縮小對(duì)目標(biāo)miRNA革E基因的篩選范圍。通過(guò)miRNA-mRNA聯(lián)合分析， 為鑒定調(diào)控腹脂沉積這類復(fù)雜性狀的miRNA提供了一個(gè)全新手段。
[0005] 綜上所述，在當(dāng)前家禽飼養(yǎng)成本急劇飆升的情勢(shì)下，利用分子標(biāo)記輔助選擇法對(duì) 腹脂沉積這一復(fù)雜性狀進(jìn)行選擇提高，可較大的提高飼料報(bào)酬，進(jìn)而節(jié)省新品系選育的成 本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種與雞腹脂沉積相關(guān)的 miRNA及其應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種與雞腹脂沉積相關(guān)的miRNA，所述 miRNA的靶標(biāo)基因是ACSLl。
[0008] 進(jìn)一步地，所述miRNA為gga-miR-19b-3p，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了前述miRNA在調(diào)控前脂肪細(xì)胞增殖和分化中的應(yīng)用，所述 miRNA通過(guò)調(diào)控ACSLl基因的表達(dá)，調(diào)控前脂肪細(xì)胞的增殖和分化。
[0010] 本發(fā)明還提供了前述miRNA作為分子標(biāo)記在遺傳標(biāo)記輔助育種和改善雞腹脂沉 積中的應(yīng)用。
[0011] 進(jìn)一步地，所述應(yīng)用具體為通過(guò)檢測(cè)雞腹脂組織中所述miRNA的表達(dá)水平，判斷 雞腹脂重/率的高低從而進(jìn)行篩選。
[0012] 本發(fā)明還提供了檢測(cè)前述miRNA表達(dá)水平的方法，所述方法包括如下步驟：
[0013] (1)提取待測(cè)雞腹脂組織中含有小RNA的總RNA;
[0014] (2)通過(guò)poly(A)聚合酶在miRNA的3'末端加上多聚A，以互補(bǔ)的多聚T為3'引 物，利用反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行miRNA反轉(zhuǎn)錄；
[0015] (3)采用miRNA特異正向引物TGTGCAAATCCATGCAAAAC
[0016] TGA及適用于加尾法的熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行g(shù)ga-miR-19b-3p的擴(kuò)增；擴(kuò)增后 利用2AAe法計(jì)算獲得gga-miR-19b_3p表達(dá)水平。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)雞腹脂組織中g(shù)ga-miR-19b_3p表達(dá)水平的熒光定量 PCR試劑盒。
[0018] 所述試劑盒包括：反轉(zhuǎn)錄試劑、目的miRNA的特異性上游引物、內(nèi)參引物和熒光定 量PCR反應(yīng)液。
[0019] 所述目的miRNA的特異性上游引物序列為T(mén)GTGCAAATCCATGCAAAACT
[0020] GA0
[0021] 內(nèi)參上游引物可以為：CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCCCTGTCTC。
[0022] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0023] 本發(fā)明提供的miRNA(gga-miR-19b-3p)與雞腹脂沉積具有很好的相關(guān)性，通過(guò)有 效性和分子生物學(xué)驗(yàn)證，gga-miR-19b-3p在高低腹脂組樣本間差異表達(dá)10倍以上。本發(fā) 明提供的miRNA可用于雞腹脂重/率相關(guān)的輔助遺傳育種中，可實(shí)現(xiàn)早期輔助選擇。
[0024] 本發(fā)明提供的檢測(cè)gga-miR-19b_3p表達(dá)水平的熒光定量PCR試劑盒包含了從RNA 提取到熒光定量實(shí)驗(yàn)所用的整套試劑，既方便使用、簡(jiǎn)化操作，又保證了結(jié)果的一致性。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖 1 為ACSLl的 3'UTR與gga-miR19b-3p的結(jié)合位點(diǎn)。
[0026] 圖2為gga-miR-19b-3p在高低腹脂表型組中相對(duì)表達(dá)量結(jié)果，**p〈0. 01。
[0027] 圖3為ACSLl在高低腹脂表型組中相對(duì)表達(dá)量結(jié)果，**p〈0. 01。
[0028] 圖4為gga-miR-19b-3p的靶基因雙熒光素酶驗(yàn)證，#p〈0. 01。
[0029] 圖5為轉(zhuǎn)染gga-miR-19b_3p模擬物后gga-miR-19b_3p的表達(dá)變化。
[0030] 圖6為過(guò)表達(dá)gga-miR-19b_3p前脂肪細(xì)胞增殖的變化。
[0031] 圖7為過(guò)表達(dá)gga-miR-19b-3p后脂滴沉積變化。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0033] 實(shí)施例1基于高通量測(cè)序技術(shù)的miRNA和mRNA聯(lián)合分析獲得腹脂沉積關(guān)鍵基因 (ACSLl)及其調(diào)控miRNA (gga-miR-19b-3p)
[0034] 1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和樣本準(zhǔn)備
[0035] 以北京油雞和科寶肉雞雜交產(chǎn)生的F2代183只母雞（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧 獸醫(yī)研究所昌平試驗(yàn)基地）為試驗(yàn)素材來(lái)源。飼養(yǎng)至93天，進(jìn)行屠宰、稱取全凈膛重和腹 脂重，計(jì)算腹脂率（腹脂重/全凈膛重）。采集腹脂組織樣本迅速放入液氮中凍存。
[0036] 根據(jù)腹脂重和腹脂率的表型數(shù)據(jù)，將腹脂重彡66. 64g、腹脂率彡5. 15%歸為高表 型組，而腹脂重< 34. 50g、腹脂率<I. 84%歸結(jié)為低表型組。從183只母雞中選取6對(duì)具 有極端表型值（極高和極低）的全同胞母雞；將選出的高、低表型組樣本，商業(yè)用試劑盒提 取腹脂組織中總RNA，組建兩個(gè)RNA等量混合池；分別構(gòu)建用于miRNA和mRNA測(cè)序的cDNA 文庫(kù)。送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。
[0037] 2)基于高通量測(cè)序結(jié)果分析差異表達(dá)miRNA和mRNA
[0038]將RPM^5、p〈0.0 5 (Fisher，s exact test和Chis quare檢驗(yàn)）且高低表型組間 差異倍數(shù)彡1. 5的miRNA定義為差異表達(dá)miRNA ;miR-19b-3p在高、低表型組中，差異倍數(shù) 達(dá)為5倍以上；差異表達(dá)mRNA的定義為：必須符合兩組中有一組的FPKM彡10、p〈0. 05且 差異倍數(shù)彡2或<0. 5。
[0039] 3)差異表達(dá)miRNA和mRNA聯(lián)合分析進(jìn)行關(guān)鍵miRNA篩選
[0040] 利用miRanda和Targetscan算法，基于雞的Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)所有差異表達(dá) miRNA和差異表達(dá)mRNA進(jìn)行聯(lián)合分析，即對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。再將預(yù)測(cè)得 到的革G基因與mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中所鑒定的差異表達(dá)mRNA進(jìn)行交集分析，交集部分定義為 "交集基因"。通過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，交集基因ACSLl在多條脂代謝信號(hào)通路中發(fā)揮作用，同 時(shí)參與不飽和脂肪酸的生物合成途徑、代謝通路、過(guò)氧化物酶體和脂肪酸代謝途徑。
[0041] 靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ACSLl的3'UTR區(qū)與gga-miR19b-3p種子序列有7個(gè)堿基 互補(bǔ)結(jié)合（圖1)。ACSLl基因?yàn)橄抡{(diào)基因，gga-miR19b-3p為上調(diào)基因，符合miRNA負(fù)調(diào) 控的功能預(yù)期，即大多數(shù)miRNA對(duì)靶基因表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用，因此推測(cè)差異表達(dá)miRNA， miR-19b-3p，參與調(diào)控ACSLl的表達(dá)。
[0042] 實(shí)施例2利用不同群體對(duì)gga-miR-19b-3p標(biāo)記與腹脂重/率的相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證
[0043] 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)miRNA和mRNA高通量測(cè)序中鑒定獲得的關(guān)鍵 gga-miR-19b-3p及ACSLl的表達(dá)進(jìn)行擴(kuò)大樣本驗(yàn)證。
[0044] 1)實(shí)驗(yàn)樣本準(zhǔn)備
[0045] 200只北京油雞（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所母雞飼養(yǎng)至93日齡，進(jìn)行 屠宰、稱取全凈膛重和腹脂重，計(jì)算腹脂率（腹脂重/全凈膛重）。采集腹脂組織樣本迅速 放入液氮中凍存。根據(jù)腹脂重和腹脂率的表型數(shù)據(jù)，基于高低組間腹脂重/率相差五倍以 上的標(biāo)準(zhǔn)，共選擇出12個(gè)（高、低表型組各6個(gè)）具有極端表型值的個(gè)體。
[0046] 2)gga-miR-19b_3p差異表達(dá)驗(yàn)證
[0047] 提取腹脂總RNA:北京天根公司總RNA提取試劑盒法ACSLImRNA定量的條件 為：試劑盒miScriptIIRTKit(Qiagen,德國(guó)）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；試劑盒QuantifastSYBR GreenPCRKit(Qiagen,德國(guó)）進(jìn)行qRT-PCR。引物為（F:CAAAGGAGAAGGTGAGGTGTG; R:CTTCAACGTACCGTTTGGTAG)。引物的終濃度為lOumol。檢測(cè)每次設(shè)