人β-catenin的核酸適配體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請涉及一種人P-Catenin的核酸適配體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素參與、多基因相互作用，并經(jīng)過多個階段醞釀，才 最終形成的極其復(fù)雜的生命現(xiàn)象。細(xì)胞癌變的過程實際上是細(xì)胞的信號通路傳導(dǎo)異常導(dǎo)致 細(xì)胞增殖、分化和凋亡失控的過程。Wnt信號通路是近來處于研究熱點的一條十分保守的 傳導(dǎo)通路。Wnt信號通路在各種癌癥類型中都處于激活狀態(tài)，Wnt激活后通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞 增殖和遷移侵襲，加劇腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。作為Wnt通路的明星分子，P-catenin信號蛋 白活性的調(diào)節(jié)是Wnt通路中的關(guān)鍵事件之一。研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤都涉及0-catenin的基 因突變、表達(dá)異常、轉(zhuǎn)位等，后來則將其定為一種新的癌基因。在膀胱癌、前列腺癌、胃癌、肝 癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌和黑色素瘤等多種人類惡性腫瘤中都有3-catenin蛋白的表達(dá)及 定位異常改變。因此，對腫瘤細(xì)胞內(nèi)3-catenin信號強(qiáng)度的計算和調(diào)控，將有利于實現(xiàn)對 細(xì)胞惡性表型的檢測和逆轉(zhuǎn)。
[0003] 核酸適配體（Aptamer)是利用體外篩選技術(shù)--指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) (Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,SELEX),從核酸分子文庫 中得到的一段DNA(脫氧核糖核酸）或者RNA(核糖核酸）寡核苷酸序列。核酸適配體能與 多種目標(biāo)物質(zhì)高特異性、高選擇性地結(jié)合。Aptamer的目標(biāo)分子廣泛，不但可以是蛋白質(zhì)、短 肽、氨基酸、化合物、抗生素、代謝小分子等，也可以是病毒顆粒和細(xì)胞系。核酸適配體已被 廣泛應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域。有研究提示，如果將核酸適配體的cDNA序列插入至一些目的 基因的5'非翻譯區(qū)內(nèi)，當(dāng)配體存在時，可在適配體局部形成非常穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，并抑制核 糖體小亞基的結(jié)合或滑動，從而可以有效沉默目的基因的翻譯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種新的人P-catenin的核酸適配體及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供一種人P -catenin的核酸適配體，其序列如SEQ ID NO :1所示。
[0006] 所述的核酸適配體作為P-catenin抑制劑的應(yīng)用。
[0007] 所述的核酸適配體在制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0008] 所述腫瘤包括膀胱癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌和黑色素瘤。所 述腫瘤細(xì)胞為膀胱癌細(xì)胞系T24。
[0009] 所述的核酸適配體在調(diào)控腫瘤細(xì)胞中P-catenin信號強(qiáng)度的應(yīng)用。
[0010] 檢測時，可以將核酸適配體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入膀胱癌細(xì)胞系T24。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是：通過設(shè)計P-Catenin的核酸適配體，能夠?qū)崿F(xiàn)對 3 -catenin的抑制，進(jìn)而能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
【附圖說明】
[0012] 圖1是本實施方式人P-catenin的核酸適配體的構(gòu)建示意圖；
[0013] 圖2是顯示0-catenin監(jiān)控系統(tǒng)能夠產(chǎn)生對細(xì)胞內(nèi)源性0-catenin信號的有效 應(yīng)答的檢測圖，其中，**表示與對照組相比，P值小于〇. 01，A指陰性對照，B指0-catenin 監(jiān)控系統(tǒng)，C指陰性對照+ 0-cateninsiRNA，D指 0 -catenin監(jiān)控系統(tǒng)+ 0-cateninsiRNA, E指P-catenin監(jiān)控系統(tǒng)+siRNA對照；
[0014] 圖3是顯示0-catenin監(jiān)控系統(tǒng)能夠有效降低0-catenin下游革E基因的表達(dá) 的檢測圖，其中，**表示與對照組相比，P值小于〇. 01，黑色長條指陰性對照，白色長條指 3-catenin監(jiān)控系統(tǒng)；
[0015] 圖4是顯示P-catenin監(jiān)控系統(tǒng)能夠有效抑制了膀胱癌細(xì)胞系T24的增殖的檢 測圖，其中，**表示與對照組相比，P值小于〇. 01，實線表示陰性對照，虛線表示P-catenin 監(jiān)控系統(tǒng)；
[0016] 圖5是顯示P -catenin監(jiān)控系統(tǒng)能夠有效誘導(dǎo)了膀胱癌細(xì)胞系T24的凋亡的檢 測圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面通過【具體實施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0018] 技術(shù)與方法
[0019] 1?細(xì)胞培養(yǎng)
[0020] 膀胱癌細(xì)胞系T24 和UM-UC-3 購自AmericanTypeCulture Collection(ATCC,Manassas,USA)，細(xì)胞培養(yǎng)液由 90 % 的DMEM(Invitrogen,CA)，10 % 的胎 牛血清（Invitrogen)，1% -2%的谷氨酰胺和0? 5% -1%的雙抗配成。
[0021] 2. 0-catenin監(jiān)控系統(tǒng)的構(gòu)建
[0022] 體外化學(xué)合成P-catenin的核酸適體序列兩個拷貝。中間以連接序列分開。引 入酶切位點StuI和NheI于該元件的上下游，同時用酶切psiCHECKTM-2雙熒光素酶表達(dá)載 體。經(jīng)T4DNA連接酶將二者連接6小時，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，搖菌、涂板、挑選陽性 克隆，并提純質(zhì)粒。
[0023] 3?細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0024] 轉(zhuǎn)染前一天，4-5XIO4個細(xì)胞接種在24孔板上，加入0. 5ml培養(yǎng)基，放在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。生長24小時后，細(xì)胞匯合度達(dá)到70%，在50ul的無血清培養(yǎng)基內(nèi)加入Iug 重組質(zhì)粒，柔和混勻。在50ul無血清培養(yǎng)基內(nèi)加入IulLipofectamin2000 (Invitrogen,CA) 試劑，輕輕混勻，室溫放置5min。將稀釋好的質(zhì)粒和Lipo2000輕柔混勻，室溫放置20分鐘， 以便形成質(zhì)粒/lipofectamin復(fù)合物。將質(zhì)粒/Iipofectamin混合物加入24孔板內(nèi)，輕柔 搖晃24孔板。放入培養(yǎng)箱內(nèi)，4-6小時后更換培養(yǎng)基，48小時后收集細(xì)胞，準(zhǔn)備下一步實驗。
[0025] 4?總RNA提取
[0026] 使用美國nvitrogen公司的Trizol試劑提取總RNA。使用紫外分光光度計和2% 瓊脂糖凝膠檢測提取的總RNA質(zhì)量。定量后于-80°C儲存?zhèn)溆谩?br>[0027]5?實時定量PCR
[0028]使用美國Fermentas的RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit把上述總 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)說明書步驟如下：取總RNA2ug，加入oligo(dT) 18(0. 5ug/ul)，加 DEPC處理的水至12ul。65°C反應(yīng)5分鐘，取出后立即置冰上。加5Xreaction buffer4ul，RNA酶抑制劑（20u/ul) Iul，dNTP (IOmM) 2ul，混勻，瞬時離心。37°C反應(yīng)5分鐘，取出后立即 置冰上。加MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200u/ul) Iul至20ul。42°C反應(yīng)60分鐘。85°C 10分鐘終止反 應(yīng)后，立即置于冰上冷卻，逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA儲存于-80°C。PCR引物由上海生工生物工程 有限公司合成。實時定量PCR引物序列如下：cyclinDl正向引物（SEQ IDNO:3) :5' -GCCA GAGGCGGAGGAGAACA-3，，反向引物（SEQ ID NO: 4) : 5，-AAGCGTGTGAGGCGGTAGTA-3，；c-myc 正向引物（SEQ ID NO: 5) : 5' -AGAGAAGCTGGCCTCCTACC-3 '，反向引物（SEQ ID NO: 6) : 5'-CGTCGAGGAGAGCAGAGAAT-3，；C0X-2正向引物（SEQ ID NO: 7) : 5，-GAATGGGGTGATGAGCAGTT-3 '，反向引物（SEQ ID NO: 8) : 5' -GCCACTCAAGTGTTGCACAT-3' ;GAPDH正向引物（SEQ ID NO :9) : 5，-CGCTCTCTGCTCCTCCTGITC-3，，反向引物（SEQ ID NO: 10) : 5' -ATCCGITGACTCCGAC 01'1^03/.64?011用作內(nèi)參。？0?總反應(yīng)體系為2〇111，包括1〇1112\411-111-〇1161%?0? Mix (GeneCopoiea Inc,美國），0.4iil正向引物，0.4iil反向引物，Ini First-Strand cDNA, 50XR0X Reference DyeO. 4ul和7. 8ul雙蒸水。使