一種編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新的編碼重組豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)Cap蛋白的基因及該基因編 碼的重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白，還涉及該重組蛋白的制備方法以及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)被認(rèn)為是與許多豬病相關(guān)的重要病原體，最初于1996年 在加拿大西部被發(fā)現(xiàn)，之后被報道為一種新的綜合征，名為仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMffS)。 PCV2屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是最小的動物病毒之一，基因組全長約I. 7kb，是單股環(huán) 狀的DNA病毒。有兩個比較大的開放閱讀框ORFl和0RF2,分別編碼Rep和Cap蛋白，R印 主要參與病毒的復(fù)制，Cap是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，可以聚集形成病毒的二十面體衣殼。PCV2Cap 蛋白免疫原性高、可與感染PCV2的豬血清反應(yīng)，因此，Cap蛋白可用作設(shè)計新型PCV2疫苗 的抗原分子，近年來成為疫苗研究的最主要靶抗原。 近年來，原核和真核表達(dá)系統(tǒng)被用于表達(dá)Cap蛋白，用于抗PCV2動物免疫。在真核表達(dá) 系統(tǒng)中，重組蛋白最重要的特性是能通過自我組裝形成病毒樣顆粒（VLPs)，重組Cap蛋白 最先在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，并已經(jīng)開放成功重組桿狀病毒亞單位疫苗。然而，任 何真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白的成本都很高，在應(yīng)用上受到限制，而原核表達(dá)系統(tǒng)則正好相反， 成本低廉。但原核表達(dá)也存在難點，例如大腸桿菌表達(dá)Cap蛋白最大的困難在于Cap蛋白 的N端是一段富含堿性氨基酸的高度保守序列，1-41位氨基酸是Cap蛋白的核定位信號肽 序列（NLS)，NLS上的特異性氨基酸使Cap蛋白表達(dá)水平很低，即使將Cap基因與GST、MBP 等蛋白融合，其表達(dá)水平仍然很低。此外，Cap蛋白大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)物多以包涵體形式 存在，使應(yīng)用進一步受到限制。
[0003]細(xì)胞分泌型多肽（CPPs)，或稱為蛋白傳輸域（PTDs)、細(xì)胞穿透肽 (cellpenetratingpeptides)、細(xì)胞穿膜肽，是一類能攜帶大分子物質(zhì)進入細(xì)胞的短肽，可 有效提高不同生物分子的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，包括質(zhì)粒DNA、寡核苷酸、短干擾RNA(SiRNA)、多肽 核苷酸（PNA)、蛋白和多肽，以及脂質(zhì)體納米顆粒在體內(nèi)體外轉(zhuǎn)移進細(xì)胞或組織，可作為將 具有生物學(xué)活性的分子轉(zhuǎn)運進入細(xì)胞的工具。目前沒有將CPPs與Cap蛋白進行融合的報 道出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對重組Cap蛋白的存在形態(tài)以及原核表達(dá)存在的難點，提供了一種新的 編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因、含有該基因的重組質(zhì)粒和重組工程菌，該重組工 程菌能表達(dá)可溶性重組PCV2Cap蛋白。 本發(fā)明還提供了上述基因編碼表達(dá)的重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白，該蛋白具有很好 的抗原性和免疫原性，且為可溶性蛋白，更便于應(yīng)用。 本發(fā)明還提供了制備上述重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的方法，該方法操作簡便，易于 實現(xiàn)。 本發(fā)明還提供了以上述重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白為有效成分的亞單位疫苗和PCV2 抗體診斷試劑盒。
[0005] 本發(fā)明為了提高Cap蛋白的表達(dá)水平以及存在形態(tài)，將Cap蛋白N端的前10個氨 基酸去除，同時與細(xì)胞分泌型多肽進行融合，得到融合蛋白，或者也可以稱為重組PCV2Cap 蛋白、重組蛋白、重組Cap蛋白。該重組PCV2Cap蛋白是由重組基因表達(dá)獲得，根據(jù)設(shè)計的 特殊引物序列，擴增出重組基因，重組基因是由缺失的Cap基因與細(xì)胞分泌型多肽基因拼 接得到的，缺失的Cap基因是缺失編碼NLS中N端前10個氨基酸的基因序列的Cap蛋白基 因。將該重組基因插入質(zhì)粒獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組工程菌，重組 工程菌表達(dá)得到可溶性重組PCV2Cap蛋白。細(xì)胞分泌型多肽CPPs包括蛋白型（P)、嵌合型 (C)和合成型（S)。本發(fā)明使用MPG、ppTG20、TAT三種細(xì)胞分泌型多肽進行研究，MPG屬于 C型，C型CPPs部分源于自然多肽或蛋白，如蛋白的信號序列可被受體蛋白識別，以協(xié)助未 成熟的蛋白經(jīng)翻譯后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞間組分的膜上。MPG嵌合了HIVgp41的融合序列和SV40T 抗原的NLS，其基因序列為GGTGCTCTGTTCCTGGGCTTCCTGGGTGCAGCGGGTTCCACGATGGGTGCCTGG TCGCAGCCGAAAAAGAAACGCAAAGTT，氨基酸序列為：617-厶1&-1^11-?116-1^11-617-?116-1^11-617-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val〇ppTG20 屬于S型，是一種a螺旋S型CPPs，其基因序列為：GGTCTGITCCGAGCACTGCTGCGACTGCTGCG ATCTCTGTGGCGACTGCTGCTGCGAGCA，氨基酸序列為：Gly-Leu-Phe-Arg-Ala-Leu-Leu-Arg-Leu -Leu-Arg-Ser-Leu-Trp-Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Ala。TAT屬于P型，是涉及HIV復(fù)制的氨基 酸86-102位點的轉(zhuǎn)錄激活因子，基因序列為：TATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA，氨基 酸序列為：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg。以缺失的Cap基因為模板， 分別與MPG、ppTG20、TAT基因拼接，得到重組基因，將所得重組基因分別進行原核表達(dá)得到 三種重組PCV2Cap蛋白。經(jīng)實驗驗證，僅有與MPG拼接形成的MPG-Cap(簡稱MrCap)重組 蛋白主要以可溶性蛋白形式存在，且可溶性蛋白表達(dá)量高，實現(xiàn)了Cap蛋白目的基因可溶 性表達(dá)。而ppTG20-Cap(簡稱prCap)和TAT-Cap(簡稱TrCap)重組蛋白主要以包涵體的 形式存在，可溶性蛋白表達(dá)量低，應(yīng)用性不強。 本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：
[0006] 一種編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因（簡稱重組PCV2Cap基因），該基因 是在缺失的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因序列的N端融合細(xì)胞分泌型多肽MPG的基因序列 所形成的，所述缺失的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因序列缺失的是編碼NLS中N端前10個 氨基酸的基因序列。 進一步的，本發(fā)明編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因的序列如SEQIDNO. 1所 示。在知道了該編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因的情況下，可以通過PCR擴增的 方式得到該基因。 本發(fā)明還提供了一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒是將上述編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋 白的基因插入pET28a(+)質(zhì)粒中構(gòu)建而得。 本發(fā)明還提供了一種重組工程菌，該重組工程菌是將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中 而得。所述大腸桿菌可以為大腸桿菌BL21。
[0007] 本發(fā)明還提供了擴增上述編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因的引物，依次 以下述a、b、c三對引物進行三次PCR擴增可以得到上述編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白 的基因序列（共進行三次PCR擴增，每次擴增依次以a、b、c作為引物，上一次擴增得到的基 因片段為下一次擴增的DNA模板，最后一次擴增得到編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的 全長基因）；
本發(fā)明重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白可以由上述重組工程菌在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)而得。
[0009]本發(fā)明還提供了上述重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的制備方法，步驟包括：將重組 工程菌進行培養(yǎng)，待菌液0D600達(dá)到0. 8-1. 0時，加入終濃度為I.Ommol/L的IPTG，繼續(xù)培 養(yǎng)5h;培養(yǎng)結(jié)束后離心收集細(xì)菌，用PBS重懸，超聲破碎收集上清液，重組豬圓環(huán)病毒2型 Cap蛋白存在于上清液中。 上述制備方法中，進一步的，將所得上清液用硫酸銨進行純化，可獲得純化的重組豬圓 環(huán)病毒2型Cap蛋白。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種新的亞單位疫苗或PCV2抗體診斷試劑盒，該亞單位疫苗或 PCV2抗體診斷試劑盒中含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白。 上述亞單位疫苗中，含有8ml重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的培養(yǎng)上清液或8ml純化 的重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白，該培養(yǎng)上清液或純化的重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白按 照上述重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的制備方法獲得。
[0011] 本發(fā)明還提供了上述亞單位疫苗的制備方法，步驟包括： (1) 將重組工程菌培養(yǎng)至菌液0D600達(dá)到0. 8-1. 0,然后加入終濃度為I.Ommol/L的 IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)5h;培養(yǎng)結(jié)束后離心收集細(xì)菌，用PBS重懸，超聲破碎收集溶有重組豬圓環(huán) 病毒2型Cap蛋白的上清液，或者將該上清液進一步用硫酸銨純化，得純化的重組豬圓環(huán)病 毒2型Cap蛋白； (2) 取8ml上述溶有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的上清液或8ml純化的重組豬圓環(huán) 病毒2型Cap蛋白，用PBS稀釋至500yg/mL，然后加入2ml佐劑，得亞單位疫苗。 所述佐劑可以為CPH佐劑，其主要成分為卡波姆和生育酚。
[0012] 為了獲得可溶性重組PCV2Cap蛋白，本發(fā)明采用PCR方法將MPG、ppTG20、TAT等穿 膜肽分別與NLS部分缺失的Cap蛋白N端基因融合構(gòu)建成新的基因分子，然后克隆至大腸 桿菌表達(dá)載體pET28a，獲得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21得重組工程菌，重組工程菌用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得可溶性重組PCV2Cap蛋白。經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot鑒定，本發(fā)明 所得重組蛋白MrCap、prCap、TrCap大小分別為33ku、32ku和31ku，其中，MrCap大部分存在 于細(xì)菌裂解上清液中，為可溶性的，可溶性蛋白表達(dá)量明顯高于PrCap和TrCap重組蛋白可 溶性表達(dá)量。將MrCap大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)菌體裂解液離心取出上清液，經(jīng)硫酸銨沉淀法純 化后，可以獲得純化的MrCap重組蛋白（CMrCap)。經(jīng)瓊脂擴散試驗（AGP)和夾心ELISA檢 測，該重組蛋白MrCap具有較好PCV2抗原性，將MrCap和CMrCap分別與CPH水佐劑混合制 成疫苗，選擇4-6周齡雌性ICR小白鼠免疫，首免后第3和6周采血，測量PCV2抗體水平， 結(jié)果為：2種不同疫苗免疫后均可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生PCV2抗體，其中，CMrCap-CPH疫苗組中和抗 體水平達(dá)1 :75,證明其具有較高的抗原性和免疫原性，為PCV2抗體檢測試劑盒和亞單位疫 苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0013] 圖1.重組PCV2Cap蛋白基因設(shè)計與構(gòu)建示意圖。 圖2.重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖，其中：1:DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；2-4:pET28a-MrCap、pET28a-prCap、pET28a-TrCap重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。 圖3.重組蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)物SDS-PAGE分析（A)及Western-blot(B)檢測圖，其中：M:蛋白 標(biāo)樣；l:BL/pET28a(+)菌體誘導(dǎo)產(chǎn)物；2