豬圓環(huán)病毒2型cap抗原制備方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒抗原制備技術(shù)領域，具體涉及豬圓環(huán)病毒2型CAP抗原制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒（PCV)首次發(fā)現(xiàn)于1974年，Tischer等人從污染的豬腎細胞系 PK-15(ATTC-CCL33)中分離到一種類似圓環(huán)病毒的新病毒，定名為豬圓環(huán)病毒（PCV)。血清 學調(diào)查表明，豬圓環(huán)病毒抗體在豬群中長期存在，但沒有相關證據(jù)表明何種疾病是該病毒 感染引發(fā)的。因此，在當時人們認為該病毒是非致病性的。一年之后，北美和歐洲在斷奶仔 豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（post-weaningmultisystemicwastingsyndrome,PMffS)患病豬身 上提取的組織中分離出類似豬圓環(huán)病毒的病原體。人們將最初無致病性的豬圓環(huán)病毒和與 PMffS爆發(fā)有關的新發(fā)現(xiàn)的分離病毒進行比較，發(fā)現(xiàn)這兩個病原體在基因結(jié)構(gòu)和抗原性上均 有不同。因此，豬圓環(huán)病毒被分為兩個亞型：從PK-15細胞系中分離出的無致病性的病毒被 命名為豬圓環(huán)病毒1型（PCVl);從患病豬身上分離出的豬圓環(huán)病毒被命名為豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2)。目前，流行病學調(diào)查顯示，PCV2已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛分布，規(guī)?；B(yǎng)殖場幾乎 沒有血清陰性的豬。自PMffS首次在加拿大爆發(fā)至今，全世界五大洲均診斷出PMffS的感染， 對大多數(shù)養(yǎng)豬國造成了極大的威脅。
[0003]PCV2是目前已知的最小的病毒之一，其基因組是一條共價閉合的單鏈DNA，近似 于I. 76kb~I. 77kb。一般認為PCV2 有 11 個開放閱讀框（openreadingframes，ORFs)， 然而僅有三個開放閱讀框被認為可以編碼蛋白。其中0RF2又稱為CAP基因，位于互補鏈 上，呈逆時針方向，負責編碼唯一的結(jié)構(gòu)蛋白CAP，其氨基酸長度為233aa~234aa。CAP蛋 白也是PCV2的主要抗原，能誘導中和抗體的產(chǎn)生。
[0004] 由于防治PCV2的重要性，有關PCV2疫苗的制備成為生物制品研發(fā)的熱點之一。 現(xiàn)有技術(shù)的PCV2疫苗主要是滅活疫苗和弱毒疫苗，但由于PCV2在體外細胞中培養(yǎng)難度 大，增殖力弱，導致現(xiàn)有技術(shù)的PCV2疫苗存在滴度較低，成本較高的缺陷。另一方面，PCV2 亞單位基因工程疫苗則有效克服了滅活疫苗和減毒活疫苗的上述缺陷，它是通過原核或 真核表達系統(tǒng)表達PCV2的結(jié)構(gòu)蛋白CAP，再以此來制備PCV2的病毒樣顆粒（Viruslike particles,VLP)，該VLP不含有病毒核酸，卻具有與病毒相似的衣殼結(jié)構(gòu)，能夠作為抗原誘 導機體免疫應答，進而產(chǎn)生抗體。然而，現(xiàn)有技術(shù)中PCV2的CAP蛋白表達效率較低，這一 方面是由于表達系統(tǒng)本身不適于CAP蛋白表達基因的表達，另一方面也反應出CAP蛋白表 達基因與現(xiàn)有技術(shù)的表達系統(tǒng)不能較好的契合，這嚴重影響了抗原的產(chǎn)量及后續(xù)疫苗的制 備。
[0005] 那么如何針對CAP蛋白表達基因自身特點獲取一套適宜的表達系統(tǒng)和配套的工 藝方法，同時實現(xiàn)CAP蛋白表達基因與表達系統(tǒng)的高效契合，將成為提升抗原制備效率的 關鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種豬圓環(huán)病毒2型CAP抗原制備方 法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中豬圓環(huán)病毒2型CAP抗原表達水平較低的技術(shù)問題。
[0007] 本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的豬圓環(huán)病毒2型CAP抗原制備方法操 作繁瑣的技術(shù)問題。
[0008] 本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是由于現(xiàn)有技術(shù)的豬圓環(huán)病毒2型CAP抗原制備方 法，所制備的CAP蛋白難以形成病毒樣顆粒，因此免疫原性較差的技術(shù)問題。
[0009] 為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0010] 豬圓環(huán)病毒2型CAP抗原制備方法，該方法是將豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白表達基 因整合到質(zhì)粒上得到重組質(zhì)粒，而后將所述重組質(zhì)粒利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達豬圓環(huán)病 毒2型CAP蛋白。
[0011] 優(yōu)選的，所述豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白表達基因是在豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白天 然表達基因基礎上，以桿狀病毒偏嗜密碼子替換其中的桿狀病毒非偏嗜密碼子所修飾后的 基因；在此基礎上進一步優(yōu)選的，所述豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白表達基因，其核苷酸序列如 SEQIDNOl所示。在該優(yōu)選技術(shù)方案中，所述豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白天然表達基因，是指 自然條件下野生型豬圓環(huán)病毒2型的CAP蛋白表達基因；所述的修飾，是指對基因的改造， 這種改造行為應當保證改造前和改造后所表達的蛋白氨基酸序列不變。
[0012] 優(yōu)選的，所述桿狀病毒表達系統(tǒng)是flashBAC桿狀病毒表達系統(tǒng)。在該優(yōu)選技術(shù)方 案中，所述flashBAC桿狀病毒表達系統(tǒng)專指由英國OxfordExpressionTechnologies公 司（0ET公司）出品的型號為"flashBAC"的桿狀病毒表達系統(tǒng)。
[0013] 優(yōu)選的，所述桿狀病毒表達系統(tǒng)以sf9昆蟲細胞作為宿主細胞。
[0014] 優(yōu)選的，所述質(zhì)粒是桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體P0ET3。
[0015] 優(yōu)選的，所述豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白表達基因是利用BamHI和XhoI雙酶切方法 獲得的；在此基礎上進一步優(yōu)選的，是先將豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白表達基因克隆至pUC57 載體，而后再利用BamHI和XhoI雙酶切方法得到大量的豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白表達基因。
[0016] 優(yōu)選的，將目的基因克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體p0ET3得到重組質(zhì)粒后，將所述重 組質(zhì)粒利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導入宿主細胞表達豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白。
[0017] 優(yōu)選的，將重組質(zhì)粒利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白后，取宿 主細胞培養(yǎng)液上清反復凍融，而后通過60~80KD菲托濾板去除細胞碎片，再通過4~6KD 濾膜濃縮，再離心濃縮，即得到所述豬圓環(huán)病毒2型CAP抗原；在此基礎上進一步優(yōu)選的， 所述離心濃縮是先以80000~120000g的速度超速離心，取沉淀，重懸，而后以20~40% 蔗糖密度梯度、130000~170000g的速度超速離心，取中間層即得到所述豬圓環(huán)病毒2型 CAP抗原。該技術(shù)方案還可以執(zhí)行以下優(yōu)選：所述凍融是反復凍融3次；所述菲托濾板的孔 徑為70KD;所述濾膜的孔徑為5KD;所述離心濃縮是先以1000 OOg的速度超速離心2h，取沉 淀，重懸，而后以20~40%蔗糖密度梯度、150000g的速度超速離心3h，取中間層即得到所 述豬圓環(huán)病毒2型CAP抗原。
[0018] 優(yōu)選的，得到重組質(zhì)粒后，先將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，利用大腸桿菌復制 該重組質(zhì)粒，再將復制后的重組質(zhì)粒利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白； 更優(yōu)的，所述大腸桿菌是大腸桿菌DH5a。
[0019] 本發(fā)明充分利用了桿狀病毒表達系統(tǒng)對外源基因克隆容量大、重組病毒易于篩 選、翻譯后加工修飾系統(tǒng)完備和表達外源基因能力強等技術(shù)特點，顯著提升了豬圓環(huán)病毒2 型CAP蛋白的表達效率，尤其是當采用重組表達基因時，仍能保持較好的CAP蛋白表達效 果。而f IashBAC桿狀病毒表達系統(tǒng)作為全新的重組桿狀病毒表達平臺，與傳統(tǒng)的表達系統(tǒng) 比較，省略了繁瑣的空斑篩選過程，一步法獲得重組病毒。不僅省時省力，并且具有更高的 蛋白表達水平、活性和穩(wěn)定性，尤其適用于難以表達的蛋白。
[0020] 此外，為了進一步提升表達效果，本發(fā)明在豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白天然表達基因 基礎上依據(jù)桿狀病毒表達系統(tǒng)對密碼子的偏愛性進行了基因修飾，從而顯著提升了重組表 達基因在桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達效率。
[0021] 在此基礎上，本發(fā)明針對桿狀病毒表達系統(tǒng)以及CAP蛋白自身特點匹配了適宜 的純化條件，該純化方法一方面具有較高的純度的收率，而且電鏡觀察發(fā)現(xiàn)以此純化的產(chǎn) 物能夠順利形成豬圓環(huán)病毒2型的病毒樣顆粒（VLP)，從而有效保證了免疫原性，為后續(xù) PCV2VLP亞單位基因工程疫苗的研制奠定了良好的基礎。本發(fā)明以嚴謹?shù)募夹g(shù)構(gòu)思實現(xiàn)了 突出的技術(shù)效果，同時成本可控、重現(xiàn)性好，因此具備優(yōu)越規(guī)?；瘧们熬啊?br>【附圖說明】
[0022] 圖1是本發(fā)明實施例中豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白天然表達基因與修飾后的基因核 苷酸序列對照圖；圖中，Optimized字樣代表修飾后的基因序列，Original字樣代表豬圓環(huán) 病毒2型CAP蛋白天然表達基因序列，二者序列存在差異的部分通過陰影表示。
[0023] 圖2是本發(fā)明實施例中重組桿狀病毒p0ET3-CAP的PCR結(jié)果；圖中，M為DNA分子 質(zhì)量標準，1為PCV2全基因擴增產(chǎn)物，2為重組桿狀病毒p0ET3-CAP上清擴增產(chǎn)物，3為重組 桿狀病毒P0ET3-CAP沉淀擴增產(chǎn)物，4為sf9細胞擴增產(chǎn)物，5為ddH20擴增產(chǎn)物。
[0024] 圖3是本發(fā)明實施例中表達產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定結(jié)果；圖中M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 標準，1為重組桿狀病毒P0ET3-CAP上清，2為重組桿狀病毒p0ET3-CAP沉淀，3為空白細胞。
[0025] 圖4是本發(fā)明實施例中表達產(chǎn)物的Western-Blot鑒定結(jié)果；圖中M為蛋白質(zhì)分子 質(zhì)量標準，1為重組桿狀病毒P0ET3-CAP上清，2為重組桿狀病毒p0ET3-CAP沉淀，3為空白 細胞。
[0026] 圖5本發(fā)明實施例中表達產(chǎn)物的間接免疫熒光鑒定圖；圖中，A為重組桿狀病毒 P0ET3-CAP感染sf9細胞48h (200 X)，B為正常sf9細胞培養(yǎng)120h (200 X)。
[0027] 圖6是本發(fā)明實施例制備的PCV2VLPS的透射電鏡圖。
【具體實施方式】
[0028] 以下將對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在 以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進行詳細描述。
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