一種評價人口腔黏膜細胞基因組穩(wěn)定性的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種評價細胞基因組穩(wěn)定性的方法，具體涉及一種評價人口腔黏膜細胞基因組穩(wěn)定性的方法，該方法是通過采集少量口腔黏膜細胞，制備成單細胞懸液，通過計數(shù)不同類型細胞及細胞中的各種遺傳損傷指標，對人口腔黏膜基因組健康進行檢測和評估，屬于細胞遺傳及分子生物技術領域。
【背景技術】
[0002]基因組的穩(wěn)定狀態(tài)是關乎個體健康狀況的最基本的物質(zhì)基礎。人體在整個生命進程中常受到輻射、重金屬污染、不當?shù)纳攀澈筒涣忌盍晳T等因素的影響，從而導致基因組穩(wěn)定性下降，并構(gòu)成潛在負面健康風險?；蚪M穩(wěn)定性下降與許多人類遺傳-環(huán)境疾病如:出生缺陷、免疫缺陷和退行性疾病(如老年性癡呆、帕金森氏病、高血壓、心血管疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、腫瘤等)危險度增加相關。通過檢測人口腔黏膜細胞基因組損傷來評估個體基因組穩(wěn)定狀態(tài)，為優(yōu)化個體基因組健康狀態(tài)提供基礎數(shù)據(jù)。
[0003]口腔黏膜基因組穩(wěn)定性分析(Buccal mucosa genomic stability assay, BMGS)是一種集遺傳損傷，細胞增殖、分化以及細胞死亡評估為一體的基因組穩(wěn)定性分析體系，涉及染色體斷裂、染色體丟失、染色體不分離、細胞壞死以及凋亡等生物學途徑，比單純的微核分析體現(xiàn)了更寬泛的遺傳和細胞損傷機制。該技術體系有兩類不同的基因組穩(wěn)定性標志:(I)遺傳損傷標志:微核(MN)(圖l，cd)和核芽(NBud)(圖l，ef) ; (2)細胞增殖狀態(tài)和死亡生物標記，包括基底細胞(BS)(圖，a)、分化細胞(DF)(圖，b)、雙核細胞(BN)(圖，g)、以及染色質(zhì)凝聚(CC)(圖，h)、核固縮(PN)(圖，i)、核溶解(KL)(圖，j)、核破裂(KH)(圖，
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[0004]MN是遺傳損傷綜合評價的一個終端標志，是染色體斷裂或染色體分離異常，在核分裂后期滯后、未進入子細胞核而游離于胞質(zhì)中形成的小塊染色質(zhì)。
[0005]NBud是細胞排除過多擴增的DNA的一種機制，起源于基因異常擴增或DNA修復復合體的排除NBud以一種柄狀染色質(zhì)結(jié)構(gòu)憑借核質(zhì)橋與細胞內(nèi)的主核相連接是基因異常擴增的生物標記。麗、NBud分別代表不同遺傳損傷的端點，但是這二者的形成彼此相關聯(lián)，共同反應了基因組的損傷狀況。
[0006]口腔粘膜基底層的基底細胞有活躍的分裂能力，能不斷分裂并維持上皮增殖、補充表層衰老或損傷脫落的細胞。BMGS中基底細胞和雙核細胞所占的比例能反映口腔上皮組織的這種再生能力；細胞在上一輪核分裂后胞質(zhì)分裂受阻可形成雙核細胞，雙核細胞中往往出現(xiàn)高頻率的染色體不分離現(xiàn)象，故雙核細胞比例可作為非整倍體發(fā)生率的生物標志。
[0007]在細胞死亡的生物學途徑里，核破裂表明核的片段化和核最終的分解，屬于細胞凋亡的晚期階段；染色質(zhì)凝聚則是細胞凋亡的早期表征；核固縮是核物質(zhì)高度濃縮但有別于染色質(zhì)凝聚和核破裂的一種核分解形式；核溶解則可能是細胞死亡進程的最后一個時期所呈現(xiàn)的細胞形態(tài)。
[0008]基因組穩(wěn)定性下降與出生缺陷、免疫系統(tǒng)缺陷、退行性疾病如老年性癡呆、帕金森氏病、高血壓、心血管疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、腫瘤等疾病相關。個體暴露于遺傳毒性物質(zhì)或微營養(yǎng)物質(zhì)的攝入不均衡都可能誘發(fā)基因組穩(wěn)定性下降，BMGS是分析評估人口腔黏膜細胞中基因組穩(wěn)定性的較好方法，為優(yōu)化個體基因組健康狀態(tài)提供基礎數(shù)據(jù)。
[0009]現(xiàn)有技術多為疾病易感性基因的檢測。通過檢測只是讓個體有知情權(quán)，了解個體的患病風險高低，并不能作出改變或校正。而本發(fā)明是對個體整個基因組健康狀況的檢測，并在了解個體遺傳背景狀況的基礎上，對可以通過營養(yǎng)干預、調(diào)整飲食和生活方式，使遺傳損傷較高的個體得到校正，利于其基因組穩(wěn)定性的維護，優(yōu)化個體基因組的健康狀態(tài)，同時降低相關疾病，特別是退行性疾病的患病風險，目前在國內(nèi)還沒有相關技術。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種評價人口腔黏膜細胞基因組穩(wěn)定性的方法。
[0011]為了達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是:
[0012]a.一種評價人口腔黏膜細胞基因組穩(wěn)定性的方法，其主要包括如下制備步驟:口腔黏膜細胞緩沖液的配制、口腔黏膜細胞的采集、單細胞懸液的制備、細胞涂片及染色鏡檢和細胞計數(shù)；
[0013]b.其中，所述的口腔黏膜細胞緩沖液的配制具體包括:稱取1.21g Tris, 37.2gEDTA-二鈉，1.2g NaCl，7.2g NaOH完全溶解，用濃鹽酸調(diào)PH至7.0，定容后，121°C高壓滅菌30min，室溫密封保存；該方法配制的緩沖液可在室溫下保存三個月，超過三月的緩沖液不能再繼續(xù)使用，需重新配置；
[0014]c.其中，所述的口腔黏膜細胞的采集具體包括:(I)取材前，志愿者先用飲用水洗漱口腔2-3遍，以清除雜物、確?？谇粌?nèi)部清潔；(2)用帶柄的小木片在臉頰內(nèi)側(cè)輕輕刮取黏膜細胞，并將其充分懸浮于裝有5-8mL細胞緩沖液的燒杯中得細胞懸浮液；
[0015]d.其中，所述的單細胞懸液的制備具體包括:⑴將細胞懸浮液轉(zhuǎn)入1mL離心管中，581g離心1min ； (2)棄上清，用5mL緩沖液重新懸浮細胞，581g離心1min ； (3)棄上清，再用3mL緩沖液懸浮細胞，用組織勻漿器勻漿3min后，經(jīng)150目的鋼網(wǎng)過濾，將濾液轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，10g離心1min ; (4)棄上清，用400 μ I緩沖液懸浮細胞，通過血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞濃度大約至80，000個/mL ;
[0016]e.其中，所述的細胞涂片及染色鏡檢具體包括:(1)向制好的單細胞懸液中加入DMSO(45-50 μ Ι/mL)作用8-lOmin ； (2)以每孔100-120 μ I懸液加入細胞涂片離心機的小孔，以52g離心5min ； (4)待裝片自然風干，卡諾氏固定液(甲醇:冰乙酸=3:1)固定1min ; (5)自然風干后，吉姆薩母液用pH為7.40.lmol/L磷酸緩沖液(A液和B液按比例混合，新鮮配制)按1: 10稀釋(通常取3ml的母液加30ml的磷酸緩沖液)，染色15min，分別用自來水、蒸餾水水洗，顯微鏡下觀察，視顏色深淺酌情復染；(6)自然晾干lOmin，用0.2%的亮綠染色20-30S，分別用自來水、蒸餾水涮洗；(7)待2h后用中性樹脂封片保存，每個樣本以制備3張裝片為宜。
[0017]f.其中，所述的細胞計數(shù)具體包括:在光學顯微鏡下(100X)計數(shù)1000個細胞中BS、DF、BN、CC、PN、KH、KL的數(shù)目，以及2000個正常的BS和DF中MN、NBud的數(shù)目；至少2人重復計數(shù)后誤差在30%以內(nèi)數(shù)據(jù)可用；每個個體各指標的頻率以千分率計算，實現(xiàn)本評價方法的準確性。
[0018]所述的各類細胞及遺傳損傷的計數(shù)標準:
[0019]基底細胞計數(shù)標準:
[0020]基底細胞是口腔細胞類型中最小的細胞，大約只有分化完全的細胞的1/4?1/3，他們具有以下特征:
[0021](I)相比于分化細胞，基底細胞有較大的核質(zhì)比例；
[0022](2)細胞質(zhì)較規(guī)整，染色較深為深綠色；
[0023](3)核呈卵圓形，染色均勻；
[0024](4)細胞中會出現(xiàn)麗或者NBud ；
[0025]分化細胞計數(shù)標準:
[0026](I)細胞呈多邊形，相較于基底細胞有較小的核質(zhì)比例；
[0027](2)細胞質(zhì)較大，染色較淺；
[0028](3)核呈卵圓形，染色均勻；
[0029](4)細胞中會出現(xiàn)MN或者NBud ；
[0030]染色質(zhì)凝聚細胞的計數(shù)標準:
[0031](I)細胞呈多邊有角狀；
[0032](2)核呈現(xiàn)出有條紋的凝聚的核染色質(zhì)；
[0033](3)染色質(zhì)凝聚區(qū)域核染色加深；
[0034]核破裂細胞的計數(shù)標準:
[0035](I)細胞呈多邊有角狀；
[0036](2)相較于染色質(zhì)凝聚細胞，核中包含大量的凝聚的染色質(zhì)；
[0037](3)核中出現(xiàn)大量斑點狀的核碎片；
[0038]核固縮細胞的計數(shù)標準:
[0039](I)細胞呈多邊有角狀；
[0040](2)核極度縮小，只有正常核2/3-1/3 ;
[0041](3)核致密染色加深；
[0042]核溶解細胞的計數(shù)標準:
[0043](I)細胞呈