一種芽孢桿菌及其高密度培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體是指一種芽孢桿菌13002及其高密度培養(yǎng) 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝結(jié)芽孢桿菌（Bacilluscoagulans)屬能產(chǎn)生芽孢的、桿菌類乳酸菌。革蘭氏陽(yáng) 性菌，代謝類型為兼性厭氧型，有氧條件較無(wú)氧條件能夠產(chǎn)更多的生物量。菌體呈桿狀，芽 孢端生，無(wú)鞭毛。最適生長(zhǎng)溫度為40 °C~50 °C，最適生長(zhǎng)pH值一般為6. 6~7. 0,發(fā)酵培 養(yǎng)可產(chǎn)乳酸。同時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌是益生菌領(lǐng)域的潛力股，具備耐高溫、耐膽鹽、耐酸等抗逆 性，對(duì)于部分抗生素和某些有害菌也有一定的抑制能力。近年來(lái)，凝結(jié)芽孢桿菌已然成為國(guó) 內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一，研究的重點(diǎn)在于如何用低廉易獲得的培養(yǎng)基獲得高密度培養(yǎng)的凝結(jié) 芽孢桿菌菌體。而國(guó)內(nèi)對(duì)于凝結(jié)芽孢桿菌的研究才處于剛起步階段。
[0003]對(duì)于微生物發(fā)酵培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，高密度培養(yǎng)技術(shù)（HCDC，highcelldensityculture) 指的是模擬人體生長(zhǎng)環(huán)境，使細(xì)胞在特定細(xì)胞生物反應(yīng)器中快速增長(zhǎng)，從而充分提高菌體 的發(fā)酵密度和生物量，或增加特定代謝產(chǎn)物的比生長(zhǎng)率的一種培養(yǎng)技術(shù)。從廣義上講，凡是 微生物培養(yǎng)至密度較高，活菌數(shù)達(dá)10 11~10 12CFU/g的均可成為高密度培養(yǎng)；實(shí)際上，由于 菌種之間的特性差異，對(duì)于生長(zhǎng)很慢的微生物，只要增長(zhǎng)至較原來(lái)提高10倍甚至更高倍數(shù) 的時(shí)候，便可以視作高密度培養(yǎng)。分批補(bǔ)料培養(yǎng)（fed-batchculture)指在培養(yǎng)的某些階 段，不定期地添加物料，使菌體及其代謝產(chǎn)物能夠持續(xù)增長(zhǎng)的培養(yǎng)技術(shù)；這是目前針對(duì)益生 菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)最完善、最經(jīng)常被使用的方式。
[0004] 申請(qǐng)?zhí)枮?01110169109. 4的中國(guó)發(fā)明申請(qǐng)公開(kāi)了"發(fā)酵乳酸菌的高密度培養(yǎng)方 法"，是采用促進(jìn)發(fā)酵乳桿菌增殖的專用培養(yǎng)基，并通過(guò)添加堿性物質(zhì)以中和菌體代謝產(chǎn)生 的酸，并適當(dāng)補(bǔ)糖，克服發(fā)酵過(guò)程中碳源短缺和產(chǎn)酸抑制菌體生長(zhǎng)的問(wèn)題。但是對(duì)培養(yǎng)條件 的優(yōu)化較少；采用的糖反饋法屬閉環(huán)控制，較為單一。
[0005] 申請(qǐng)?zhí)枮?01310742351. 5的中國(guó)發(fā)明申請(qǐng)公開(kāi)了"一種用于芽孢桿菌的高密度 培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基"，適用于地衣芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌的高密度培養(yǎng)，得到的發(fā)酵液中 芽孢形成率可在90%以上，芽孢密度最低在120億/毫升以上。但是沒(méi)有說(shuō)明是否適用于 凝結(jié)芽孢桿菌，也沒(méi)有指出芽孢桿菌經(jīng)高密度培養(yǎng)后達(dá)到的具體活菌數(shù)。
[0006] 申請(qǐng)?zhí)枮?01410516317.0的中國(guó)發(fā)明申請(qǐng)公開(kāi)了"一種植物乳桿菌及其高密度 培養(yǎng)方法"，是通過(guò)pH不再降低來(lái)判斷是否到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)，同時(shí)指出該菌株具有良好的酸耐 受性、膽鹽耐受性及抑制常見(jiàn)腸道致病菌生長(zhǎng)特性。但是沒(méi)有采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)法，僅靠自 然發(fā)酵不足以使菌種高密度培養(yǎng)達(dá)到最優(yōu)水平。
[0007]上述現(xiàn)有技術(shù)指出高密度培養(yǎng)的限制因素和解決方法，主要包括：底物、產(chǎn)物或代 謝副產(chǎn)物的負(fù)反饋?zhàn)饔茫慌囵B(yǎng)條件包括培養(yǎng)溫度、pH值、溶氧量等的抑制作用。具體辦法 包括添加中和劑控制PH，添加碳源減少底物抑制等等，但仍存在適用范圍受限、優(yōu)化條件不 足、方法選擇單一等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種芽孢桿菌13002及其高密度培養(yǎng)方法。既符合該菌種的 研究趨勢(shì)，也為該菌種的深入研究及實(shí)際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
[0009] 本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] 本發(fā)明芽孢桿菌13002,由荔枝汁中分離篩選得到，該芽孢桿菌菌株具有如下性 質(zhì)：
[0011] (1)形態(tài)特征：革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在一定條件下可產(chǎn)生芽孢，為兼性菌，菌體為桿 狀，單個(gè)排列，寬約〇? 5~1. 0ym，長(zhǎng)約3. 0~5. 0ym。
[0012] (2)生理特征：接觸酶、過(guò)氧化氫酶、V-P實(shí)驗(yàn)、硫化氫都為陽(yáng)性，能水解酪蛋白、 明膠和淀粉，能利用檸檬酸鹽、硝酸鹽，不能利用丙酸鹽，吲哚實(shí)驗(yàn)為陰性，最高生長(zhǎng)溫度為 65°C;能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、甘露糖、木糖、乳糖、半乳糖，不能利用鼠李糖。
[0013] 16SrDNA測(cè)序結(jié)果見(jiàn)核苷酸序列表，測(cè)序結(jié)果表明該菌株的序列與凝結(jié)芽孢桿菌 的同源性達(dá)到100% ;同時(shí)根據(jù)生理生化的結(jié)果，鑒定該菌為凝結(jié)芽孢桿菌。
[0014] -種芽孢桿菌的高密度培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0015] (1)將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的芽孢桿菌13002的菌懸液于種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培 養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液；所述種子培養(yǎng)基為：按照質(zhì)量比計(jì)算，細(xì)菌學(xué)蛋白胨〇. 2份~1. 0份， 酵母提取粉〇. 1份~〇. 5份，葡萄糖1. 0份~2. 0份，NaCl0. 5份~1. 5份，用蒸餾水定容 至100份，調(diào)節(jié)pH至6. 0~7. 5,滅菌后冷卻即可；
[0016] (2)以體積比2~10 :100的比例，將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵 培養(yǎng)至16h~36h收集發(fā)酵培養(yǎng)液；
[0017] (3)將發(fā)酵培養(yǎng)液離心后收集菌泥，用生理鹽水清洗后收集菌泥，按保護(hù)劑與濕菌 泥體積比3~5 :1，加入菌種保護(hù)劑后，混合均勻后，進(jìn)行干燥，得菌粉。
[0018] 所述菌種保護(hù)劑為10%海藻糖生理鹽水溶液。
[0019] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：按照質(zhì)量比計(jì)算，細(xì)菌學(xué)蛋白胨0. 5份~1. 75份，酵母提取粉 1. 0份~2. 75份，葡萄糖1. 25份~4. 0份，NaCl0. 5份~1. 5份，用蒸餾水或發(fā)酵培養(yǎng)基 緩沖液定容至100份，調(diào)節(jié)pH至6. 0~7. 5,滅菌后冷卻即可。
[0020] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基中細(xì)菌學(xué)蛋白胨1. 0份，酵母提取粉2. 5份，葡萄糖2. 0份，NaCl 1.0 份。
[0021 ] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基緩沖液為Na2HP04-檸檬酸、Na2HP04-NaH2P〇dPKH2P04-Na0H緩沖液 中的一種或兩種，并用其中的一種或兩種以上來(lái)調(diào)節(jié)pH。
[0022] 當(dāng)發(fā)酵至16h~24h時(shí)，補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)至24h~36h收集發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0023] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的補(bǔ)料速率為0.5gAL?h)~1. 5gAL?h)的恒定速率補(bǔ)料，以 葡萄糖的濃度計(jì)。
[0024] 所述種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的pH均為6. 5 ;所述發(fā)酵是在發(fā)酵罐中自動(dòng)發(fā)酵。
[0025] 所述發(fā)酵培養(yǎng)溫度為35°C~55°C。
[0026] 所述種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為6 :100 ;發(fā)酵培養(yǎng)溫度為45°C。
[0027] 所述干燥為真空冷凍干燥、噴霧干燥或流化床干燥。
[0028] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0029] (1)本發(fā)明芽孢桿菌13002高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其中，酵母提取粉來(lái)源于食用酵 母，富含氨基酸、維生素等多種生長(zhǎng)因子，細(xì)菌學(xué)蛋白胨總氮含量較高，兩者協(xié)同作用使培 養(yǎng)基能夠發(fā)揮更好的效果。
[0030] (2)本發(fā)明利用緩沖體系來(lái)控制pH以促使芽孢桿菌13002進(jìn)行高密度培養(yǎng)，在該 條件下培養(yǎng)所得的活菌數(shù)高達(dá)2. 138X109CFU/mL，提高至優(yōu)化前的1. 73倍，較好地解決了 培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)酸抑制菌體生長(zhǎng)的問(wèn)題。
[0031] (3)本發(fā)明采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)法，在發(fā)酵罐中自動(dòng)發(fā)酵，于菌種生長(zhǎng)對(duì)數(shù)末 期，以0. 5gAL?h)的恒定速率添加發(fā)酵培養(yǎng)基，最終測(cè)得芽孢桿菌13002活菌總數(shù)是 3. 095X109CFU/mL，凍干后活菌總數(shù)達(dá)0. 730X10nCFU/g，既達(dá)到了高密度培養(yǎng)的目標(biāo)，也 較好地克服了培養(yǎng)過(guò)程中底物和產(chǎn)物抑制的問(wèn)題。
[0032] (4)本發(fā)明公開(kāi)的菌株是嗜熱菌，在溫度35°C~55°C中都能進(jìn)行生長(zhǎng)和發(fā)酵，在 高溫環(huán)境下進(jìn)行發(fā)酵和生長(zhǎng)，不容易污染雜菌。
[0033] (5)本發(fā)明公開(kāi)的菌株經(jīng)急性毒理實(shí)驗(yàn)證實(shí)是食用安全的，是一株潛在的益生菌， 既可以用于菌粉，也可以用于高光學(xué)純度的L-乳酸的發(fā)酵。
[0034] 所述芽孢桿菌（Bacillussp. ) 13002,已于2013年4月8日保藏于中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱：CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo.7431。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1為實(shí)施例1中芽孢桿菌13002生長(zhǎng)曲線；
[0036] 圖2為實(shí)施例1中不同耐受溫度對(duì)芽孢桿菌13002生長(zhǎng)影響；
[0037] 圖3為實(shí)施例1中不同耐膽鹽時(shí)間對(duì)芽孢桿菌13002生長(zhǎng)影響；
[0038] 圖4為實(shí)施例1中不同耐酸時(shí)間對(duì)芽孢桿菌13002生長(zhǎng)影響；
[0039] 圖5為實(shí)施例1中搖瓶分批補(bǔ)料培養(yǎng)對(duì)芽孢桿菌13002生長(zhǎng)影響；
[0040] 圖6為實(shí)施例1中搖瓶和自動(dòng)發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)對(duì)芽孢桿菌13002生長(zhǎng)影響。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明 要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表示的范圍。
[0042] 實(shí)施例1
[0043] (1)將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的芽孢桿菌13002的菌懸液于種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行連續(xù) 2~3次活化培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液；所述種子培養(yǎng)基為：按照質(zhì)量比計(jì)算，細(xì)菌學(xué)蛋白 胨1. 0份，酵母提取粉0. 5份，葡萄糖2. 0份，NaCl1. 0份，用蒸餾水定容至100份，用 Na2HP04_NaH2P04緩沖液調(diào)節(jié)pH至6.5,滅菌后冷卻備用；
[0044] (2)以體積比6 :100的比例，將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于45°C進(jìn)行搖瓶 培養(yǎng)，至24h培養(yǎng)結(jié)束，得發(fā)酵培養(yǎng)液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：按照質(zhì)量比計(jì)算，細(xì)菌學(xué)蛋白胨 1. 〇份，酵母提取粉1. 〇份，葡萄糖2. 0份，NaCl1. 0份，用蒸餾水定容至1