一種體外刺激外周血γδT細(xì)胞高效增殖的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種體外刺激外周血YsT細(xì)胞高效增 殖的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 過繼細(xì)胞免疫治療是癌癥治療的一種強(qiáng)有力的手段，該治療采用體外方法大量擴(kuò) 增T細(xì)胞。"快速擴(kuò)增程序（REP)"是一種生產(chǎn)出大量的T淋巴細(xì)胞行之有效且常規(guī)使用的 方法?？焖贁U(kuò)增程序是一種抗原非依賴性的方案，該方案采用過量的致死劑量伽瑪輻照異 體外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，同時(shí)使用抗CD3抗體（0KT3)和外源重組人 白細(xì)胞介素（rhIL)-2。白細(xì)胞介素-2是一種T細(xì)胞增殖和生長所需的強(qiáng)有力的T細(xì)胞有絲 分裂原。外周血表達(dá)Fc-yl受體（FcyRI)，它可以與抗⑶3抗體免疫球蛋白（Ig)的Fc段 相互作用。作為一種抗⑶3抗體，0KT3可綁定到T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR)-⑶3-復(fù) 合物上?？耿?-T細(xì)胞受體交聯(lián)以及通過綁定到⑶3的抗體Fc而產(chǎn)生的T細(xì)胞和外周血 單個(gè)核細(xì)胞之間的相互作用，可同時(shí)提供信號(hào)1和共刺激信號(hào)-2,導(dǎo)致T細(xì)胞增殖而不會(huì)引 發(fā)無能或早期凋亡。這種快速擴(kuò)增程序可以致使T淋巴細(xì)胞在14天內(nèi)擴(kuò)增1000倍。
[0003] 雖然快速擴(kuò)增程序是一種常用的方法，但它的應(yīng)用受到材料和技術(shù)上的限制。在 臨床應(yīng)用快速擴(kuò)增程序時(shí)，一個(gè)T細(xì)胞中通常會(huì)用200個(gè)外周血單核細(xì)胞來刺激。所以快 速擴(kuò)增程序需要用血細(xì)胞分離機(jī)大容量白細(xì)胞單采術(shù)從多個(gè)健康的捐助者收集大量異體 外周血單個(gè)核細(xì)胞?？焖贁U(kuò)增方案中所收集的外周血單個(gè)核細(xì)胞來自異體，需要經(jīng)過大量 的實(shí)驗(yàn)室檢測，以確認(rèn)處于無菌狀態(tài)，這可能既昂貴又費(fèi)時(shí)。由于外周血單個(gè)核細(xì)胞來自于 多個(gè)捐助者，收集而來的外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞擴(kuò)增的維持作用在捐助者個(gè)體間可能 會(huì)表現(xiàn)出很大的差異性。所有這些問題都會(huì)對(duì)大型多中心隨機(jī)臨床試驗(yàn)有所妨礙。
[0004] 為了克服以上快速擴(kuò)增程序的問題，基因工程改造過的人類紅白血病細(xì)胞株K562 細(xì)胞已經(jīng)被用來取代外周血單個(gè)核細(xì)胞。K562細(xì)胞本身既不表達(dá)內(nèi)源性的HLAII類分 子（因此減少了同種異體反應(yīng)），也不表達(dá)諸如CD86、CD83、4-1BBL、0X40L、IC0SL(B7H2， B7RP1)或CD40L等共刺激分子。K562細(xì)胞也不表達(dá)抑制分子，如H)L1 (B7H1)，PDL2 (B7DC)， B7H3和B7H4 (B7X，B7S1)。在三種人類IgGFc受體中，K562細(xì)胞內(nèi)源性高表達(dá)CD32,而CD16 或⑶64并不會(huì)高表達(dá)。K562細(xì)胞表達(dá)黏附分子⑶54 (ICAM-1)和⑶58 (LFA-3)，這會(huì)增強(qiáng) K562細(xì)胞與T細(xì)胞間的相互作用并提高T細(xì)胞的增值效率。基因工程改造K562很容易進(jìn) 行，轉(zhuǎn)基因在改建后的K562細(xì)胞中的表達(dá)比較穩(wěn)定。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)已證實(shí)使用K562為飼 養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行T細(xì)胞擴(kuò)增是一種安全可靠的方法。
[0005] 絕大多數(shù)T淋巴細(xì)胞屬于a0T細(xì)胞。它們的T細(xì)胞受體由a和0鏈組成。一 個(gè)小部分T淋巴細(xì)胞表達(dá)T細(xì)胞受體gamma和delta異二聚體（yS)鏈。yST細(xì)胞在腫 瘤和感染的免疫監(jiān)視方面起到重要作用。YST細(xì)胞能夠滲入人體實(shí)體腫瘤內(nèi)部，影響腫 瘤生長并且殺死癌細(xì)胞。能被YST細(xì)胞滲入實(shí)體腫瘤包括腎癌、膀胱癌、卵巢癌、結(jié)直腸 癌、乳腺癌和鼻咽癌。Vy9VS2T細(xì)胞是人類外周血yST細(xì)胞的主要亞群，幾個(gè)早期階段 的過繼免疫治療癌癥的臨床試驗(yàn)已經(jīng)使用了Vy9Vs2T細(xì)胞。
[0006]Vy9VS2T細(xì)胞只占外周血T細(xì)胞一小部分，大約0.5-5%。為了有足夠量的 Vy9VS2T細(xì)胞進(jìn)行過繼細(xì)胞免疫治療，病人往往需要經(jīng)過大容量白細(xì)胞單采術(shù)來收集 大量外周血單核細(xì)胞。單采術(shù)技術(shù)可收集1X109個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞，生產(chǎn)幾十億的 Vy9VS2T細(xì)胞用于多次注射。IPP(異戊烯焦磷酸）是人類yST細(xì)胞Vy9VS2亞群的 天然抗原，已用于yST細(xì)胞的擴(kuò)增。異戊烯焦磷酸的合成類似物溴醇焦磷酸（BrHPP)及 雙膦酸鹽唑來膦酸（Zometa)也可以選擇性地激活擴(kuò)增人類Vy9VS2T細(xì)胞。這些化合物 現(xiàn)在已廣泛用于Vy9VS2T細(xì)胞的體外擴(kuò)增。唑來膦酸是美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的， 市場上可以買到的治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的雙膦酸鹽藥物。這種藥物抑制法尼基焦磷酸合 酶（FPP)，該酶在甲羥戊酸通路中的異戊烯焦磷酸下游發(fā)揮作用，因此可以增加細(xì)胞內(nèi)的異 戊烯焦磷酸的水平。
[0007] 在本發(fā)明將K562細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾從而產(chǎn)生可應(yīng)用于大規(guī)模擴(kuò)增YST細(xì)胞的 飼養(yǎng)層細(xì)胞。經(jīng)過遺傳修飾的K562細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)CD64高親和力Fc受體基因，共刺激分子 ⑶86,和共刺激分子⑶137L基因（4-1BBL)。⑶137L是4-1BB受體的配體，主要表達(dá)在活化 的T細(xì)胞表面上。⑶137信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與抑制激活誘導(dǎo)性細(xì)胞死亡，與⑶4+T細(xì)胞相比，這會(huì) 有利于⑶8+T細(xì)胞的擴(kuò)增。⑶137也會(huì)增強(qiáng)記憶型⑶8T細(xì)胞的發(fā)育。⑶86是⑶28共刺激 受體的配體，而⑶28在靜息和激活的T細(xì)胞中均有表達(dá)。通過⑶64與0KT3抗⑶3單克隆 抗體的Fc部分相互作用，第一信號(hào)（0KT3-⑶3)以及⑶86-⑶28和⑶137L-⑶137共刺激信 號(hào)會(huì)雙信號(hào)同時(shí)刺激T淋巴細(xì)胞。K562細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞已用于a0T細(xì)胞擴(kuò)增，但它們對(duì) Vy9VS2T細(xì)胞的擴(kuò)增能力尚待確定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中Vy9Vs2T細(xì)胞的擴(kuò)增能 力差，抗腫瘤細(xì)胞毒性差的技術(shù)瓶頸，從而提出一種擴(kuò)增能力高并且，具備完整的抗腫瘤細(xì) 胞毒性，可殺死實(shí)體腫瘤細(xì)胞和非實(shí)體腫瘤細(xì)胞的體外刺激外周血YST細(xì)胞高效增殖的 方法。
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種體外刺激外周血yST細(xì)胞高效增殖的 方法，所述方法為：
[0010] 1)將目的基因⑶64,⑶86,和⑶137L插入到K562細(xì)胞的基因座中得到單克隆細(xì) 胞株；
[0011] 2)從外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞，并用唑來膦酸和白細(xì)胞介素-2預(yù)處理外周血單 個(gè)核細(xì)胞；
[0012] 3)預(yù)處理過的外周血單個(gè)核細(xì)胞與遺傳修飾過的K562細(xì)胞共同培養(yǎng)，并加入 0KT3抗體和白細(xì)胞介素-2。
[0013] 優(yōu)選的，所述的體外刺激外周血yST細(xì)胞高效增殖的方法，其中，所述基因座為 人類第19號(hào)染色體AAVS1基因座。
[0014] 優(yōu)選的，所述的體外刺激外周血YsT細(xì)胞高效增殖的方法，其中，所述方法的步 驟1)的具體步驟為：采用鋅指核酸酶技術(shù)，以位點(diǎn)特異性的方式引導(dǎo)將目的基因插入到K562細(xì)胞人類第19號(hào)染色體AAVS1基因座；然后用嘌呤霉素對(duì)改造后的K562細(xì)胞進(jìn)行篩 選，以獲得單克隆細(xì)胞株；最后用流式細(xì)胞儀分析篩選得到的高表達(dá)目的基因的單細(xì)胞克 隆株。
[0015] 優(yōu)選的，所述的體外刺激外周血yST細(xì)胞高效增殖的方法，其中，所述方法的步 驟2)的具體步驟為：先用淋巴細(xì)胞分離液通過密度梯度離心法從白細(xì)胞層將外周血單個(gè) 核細(xì)胞分離出來。再將外周血單個(gè)核細(xì)胞種植到孔板中，使用A頂-V培養(yǎng)基，并加入唑來膦 酸和人類重組白細(xì)胞介素-2刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞。
[0016] 更為優(yōu)選的，所述的體外刺激外周血yST細(xì)胞高效增殖的方法，其中，所述唑來 膦酸為5yM;所述0KT3抗體為50ng/ml。
[0017] 優(yōu)選的，所述的體外刺激外周血yST細(xì)胞高效增殖的方法，其中，所述人類重組 白細(xì)胞介素-2為300IU/ml;外周血單個(gè)核細(xì)胞的密度2X106/ml。
[0018] 進(jìn)一步的，所述的體外刺激外周血yST細(xì)胞高效增殖的方法，其中，所述方法的 步驟3)的具體步驟為：當(dāng)細(xì)胞激活并擴(kuò)增后，用修飾過的K562細(xì)胞，0KT3抗體，白細(xì)胞介 素2和唑來膦酸混合物共培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行yST細(xì)胞擴(kuò)增；共培養(yǎng)時(shí)添加0KT3抗體，重組人 白細(xì)胞介素-2和唑來膦酸促進(jìn)yST細(xì)胞進(jìn)一步增殖。
[0019]更為進(jìn)一步的，所述的體外刺激外周血yST細(xì)胞高效增殖的方法，其中，所述K562細(xì)胞擴(kuò)增使用前先經(jīng)y輻照或與混有絲裂霉素C處理滅活。
[0020] 本發(fā)明還公開了任一所述的體外