轉(zhuǎn)基因玉米mir162雙重?cái)?shù)字pcr熒光定量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及轉(zhuǎn)基因玉米MIR162雙重?cái)?shù) 字PCR熒光定量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自1996年首例轉(zhuǎn)基因番茄在美國成功商業(yè)化以來，對于轉(zhuǎn)基因作物的研究近 二十年來取得了迅速的發(fā)展。根據(jù)ISAAA統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，截至2014年，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植 面積已經(jīng)達(dá)到1. 8億公頃，比1996年種植面積提高了近100倍，占全球作物種植總面積的 3. 4%。轉(zhuǎn)基因作物的快速發(fā)展不僅為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)提供了更加便利的育種方式，也由于其未知 的安全隱患引起了各個國家和地區(qū)的廣泛關(guān)注。為此，各國家和地區(qū)紛紛建立起轉(zhuǎn)基因成 分的標(biāo)識制度。在全球各國家和地區(qū)制定的轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識制度中，定量標(biāo)識制度占據(jù)較 大比重，其中以歐盟和日韓最具代表性。我國在轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識方面主要采取定性標(biāo)識制 度，由于定性標(biāo)識制度與定量標(biāo)識制度在檢測技術(shù)等方面存在不同，使我國在作物進(jìn)出口 方面容易受到國際標(biāo)準(zhǔn)的制約。為此，我國需要大力發(fā)展轉(zhuǎn)基因成分定量檢測技術(shù)并建立 相關(guān)定量標(biāo)識制度。
[0003] 數(shù)字PCR(Digital-PCR)是一種新型的絕對定量PCR檢測方法，是一項(xiàng)檢測和定 量核酸的新技術(shù)，其基本原理是通過將微量樣品進(jìn)行大倍數(shù)稀釋和分液，直至每個樣品中 所含有的待測分子數(shù)不超過1個，再將所有樣品在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有PCR擴(kuò)增 熒光信號記為1，無熒光信號記為0,有熒光信號的反應(yīng)單元中至少包含一個拷貝的目標(biāo)分 子，針對反應(yīng)結(jié)果采用泊松分布（Poissondistribution)公式，便可計(jì)算出樣本的最初 拷貝數(shù)或濃度。該技術(shù)不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值，也無需看家基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可 實(shí)現(xiàn)DNA絕對定量。該技術(shù)在基因拷貝數(shù)變化分析（copynumbervariation,CNV)(Qin etal.，2008)、遺傳突變檢測（Yungetal.，2009)、基因分型（Loetal.，2007)、基因定 量（Warrenetal.，2010)、單細(xì)胞基因表達(dá)（Guoetal.，2010)等方面的研究取得了突破 性的發(fā)展，在臨床方面為癌癥、腫瘤等疾病檢測提供了新的診斷方法。在轉(zhuǎn)基因檢測方面， Corbisier等（2010)利用數(shù)字PCR分析了玉米種子DNA中外源基因和內(nèi)參基因的拷貝數(shù)之 比，該結(jié)果與利用普通熒光定量PCR技術(shù)以質(zhì)粒DNA為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測的結(jié)果相同，證明了數(shù) 字PCR的可靠性。Burns等（2010)評估了數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因檢測中檢測限（L0D)和定量限 (L0Q)，探索了數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因檢測方面的可行性和反應(yīng)條件，表明數(shù)字PCR能夠?qū)ζ鹗?模板拷貝數(shù)進(jìn)行絕對定量。然而利用數(shù)字PCR對轉(zhuǎn)基因檢測的研究還處于起步階段?，F(xiàn)有 數(shù)字PCR檢測方法都需要經(jīng)過樣品前處理過程，在實(shí)際檢測中，前處理過程往往會導(dǎo)致實(shí) 驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差。因此現(xiàn)有的數(shù)字PCR檢測方法不適合直接作為轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種不需要進(jìn)行樣品前處理步驟的，針對轉(zhuǎn)基因玉米MIR162 的雙重?cái)?shù)字PCR熒光定量檢測方法，可實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的絕對定量。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供用于轉(zhuǎn)基因玉米MIR162雙重?cái)?shù)字PCR熒光 定量檢測的引物和探針組合，所述引物和探針組合為：
[0006]外源基因正向引物：5' -GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAG-3'
[0007]外源基因反向引物：5' -TGCCTTATCTGITGCCTTCAGA-3'
[0008]外源基因探針：5' -FAM-TCTAGACAAITCAGTACATTAAAAACGTCCGCCA-BHQ1-3'
[0009]內(nèi)參基因adhl-70 正向引物：5' -CCAGCCTCATGGCCAAAG-3'
[0010] 內(nèi)參基因adhl-70 反向引物：5' -CCTTCTTGGCGGCTTATCTG-3'
[0011] 內(nèi)參基因adhl-70 探針：5' -VIC-CTTAGGGGCAGACTCCCGTGTTCCCT-BHQ1-3'。
[0012] 本發(fā)明還提供含有所述引物和探針組合的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162數(shù)字PCR雙重?zé)晒?定量檢測試劑盒。
[0013] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽 性模板等中的至少一種。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步提供轉(zhuǎn)基因玉米MIR162雙重?cái)?shù)字PCR熒光定量檢測方法，所述方法 包括以下步驟：
[0015]1)提取待測樣品的基因組DNA ;
[0016]2)以提取的基因組DNA為模板，利用所述的引物和探針組合，進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增反 應(yīng)；
[0017] 3)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0018] 其中，數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系以4yl計(jì)為：基因組DNAlyl，225nM外 源基因正、反向引物各0. 04yl，225nM內(nèi)參基因正、反向引物各0. 04yl，50nM外源基因 探針 0? 02yl，50nM內(nèi)參基因探針 0? 02yl，2XMasterMix(購自Fluidigm公司）2y1， 20XLoadingReagent(購自Fluidigm公司）0? 4y1，ddH20 補(bǔ)足至 4y1〇
[0019] 數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?0°C熱激活300s;95°C預(yù)變性300s;95°C變性15s， 60°C退火及延伸60s，共50個循環(huán)；在60°C下采集熒光信號。
[0020] 前述的方法，步驟3)中檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體如下：在數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后， 記錄各反應(yīng)孔中外源基因和內(nèi)參基因的熒光信號值，通過泊松分布公式計(jì)算各反應(yīng)孔中外 源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)，通過兩者的拷貝數(shù)之比得到轉(zhuǎn)基因成分的絕對濃度。
[0021] 本發(fā)明是在PCR芯片中進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)。將每個加樣孔作為一個整體，加入 轉(zhuǎn)基因作物數(shù)字PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行實(shí)時熒光擴(kuò)增，通過監(jiān)測每個反應(yīng)孔中的熒光信號值， 獲得所有反應(yīng)孔中的總體擴(kuò)增曲線和熱點(diǎn)圖。
[0022] 檢測結(jié)果的判定按照以下方式進(jìn)行：
[0023] 1、在利用數(shù)字PCR進(jìn)行擴(kuò)增的過程中，陽性孔的判定方法為：出現(xiàn)明顯區(qū)別于陰 性反應(yīng)孔（陰性反應(yīng)孔中模板為1y1ddH20)的擴(kuò)增信號，將該反應(yīng)孔記為陽性擴(kuò)增孔；陽 性樣品的判定方法為：在相同樣品的三個平行組內(nèi)，至少出現(xiàn)一組有陽性擴(kuò)增孔，則表明檢 測樣品基因組中含有轉(zhuǎn)基因作物成分；
[0024] 2、在數(shù)字PCR擴(kuò)增結(jié)束后，記錄每個擴(kuò)增孔中外源基因和內(nèi)參基因的亮點(diǎn)數(shù)，通 過泊松分布公式計(jì)算每個孔中外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)，通過兩者的拷貝數(shù)之比得到 轉(zhuǎn)基因成分的絕對濃度；
[0025] 3、每個樣品設(shè)置三個平行組，通過統(tǒng)計(jì)分析得到三個平行組內(nèi)轉(zhuǎn)基因成分濃度的 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（1?0)，1?0<25%表明定量結(jié)果有意義；
[0026] 4、當(dāng)待測樣品反應(yīng)孔中為陰性結(jié)果時，表明未檢測到轉(zhuǎn)基因作物成分；當(dāng)待測樣 品反應(yīng)管中為陽性結(jié)果時，表明待測樣品中含有轉(zhuǎn)基因作物成分。
[0027] 本發(fā)明方法可以直接對待檢測樣品的基因組中的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162進(jìn)行定量檢 測，從而省去了現(xiàn)有的數(shù)字PCR方法中的樣品前處理步驟，使得檢測過程簡便易行，避免了 前處理步驟對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的不良影響。另外，在本發(fā)明方法中，由于轉(zhuǎn)基因成分是通過 外源基因拷貝數(shù)與內(nèi)參基因拷貝數(shù)的比例計(jì)算得到的，因此在同一個反應(yīng)體系進(jìn)行雙重檢 測可以提尚轉(zhuǎn)基因成分定量檢測的穩(wěn)定性。
[0028] 利用本發(fā)明提供的雙重?cái)?shù)字PCR熒光定量檢測方法和檢測試劑盒可以實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn) 基因玉米MIR162的絕對定量檢測，本方法定量檢測限可達(dá)到0. 5%，靈敏度可達(dá)到0. 1%， 能夠滿足轉(zhuǎn)基因成分實(shí)際檢測的需要。此外，本方法操作簡單，靈活性強(qiáng)，是一種轉(zhuǎn)基因絕 對定量檢測的有效方法。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162外源基因引物探針與不同內(nèi)參基 因引物探針組合的擴(kuò)增效果圖；其中，A為與內(nèi)參基因adhl-70bp組合，B為與內(nèi)參基因 adhl-135bp組合，C為與內(nèi)參基因hmga-79bp組合，D為與內(nèi)參基因zssllb-88bp組合。
[0030] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品系特異性檢測結(jié)果；其中，橫坐標(biāo) 為不同轉(zhuǎn)基因玉米品系，縱坐標(biāo)為利用雙重?cái)?shù)字PCR法擴(kuò)增得到的外源基因拷貝數(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0032] 實(shí)施例1用于轉(zhuǎn)基因玉米MIR162雙重?cái)?shù)字PCR熒光定量檢測的引物和探針組合 的設(shè)計(jì)
[0033] 根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品系外源基因插入序列及邊界序列設(shè)計(jì)了如下用于轉(zhuǎn)基 因玉米MIR162雙重?cái)?shù)字PCR熒光定量檢測的引物和探針組合（SeqIDNo. 1-6):
[0034]外源基因正向引物：5' -GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAG-3'
[0035]外源基因反向引物：5' -TGCCTTATCTGITGCCTTCAGA-3'
[0036]外源基因探針：5' -FAM-TCTAGACAAITCAGTACATTAAAAACGTCCGCCA-BHQ1-3'
[0037]內(nèi)參基因adhl-70 正向引物：5' -CCAGCCTCATGGCCAAAG-3'
[0038]內(nèi)參基因adhl-70 反向引物：5' -CCTTCTTGGCGGCTTATCTG-3'
[0039] 內(nèi)參基因adhl-70 探針：5' -VIC-CTTAGGGGCAGACTCCCGTGTTCCCT-BHQ1-3'。
[0040] 實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因玉米MIR162雙重?cái)?shù)字PCR定量檢測方法的建立
[0041]1.1實(shí)驗(yàn)材料
[0042] 本實(shí)施例中使用的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162樣品及其親本非轉(zhuǎn)基因樣品，轉(zhuǎn)基因玉米 品系NK603、M0N810、Btl76、M0N863、3272、MIR604均由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供。PCR 芯片購自美國Fluidigm公司，型號為48. 770DigitalArrayChip;BioMarkHD高通量基 因分析系統(tǒng)（BiomarkHDSystem)購自Fluidigm公司。
[0043] 1. 2實(shí)驗(yàn)用轉(zhuǎn)基因作物種子樣品基因組DNA提取
[0044] (1)將作物種子樣品研磨并徹底風(fēng)干；
[0045] (2)將轉(zhuǎn)基因玉米品系與親本非轉(zhuǎn)基因種子樣品進(jìn)行不同比例的混合，并通過混 勻儀器的過夜混勻得到實(shí)驗(yàn)用的不同轉(zhuǎn)基因濃度的樣品；
[0046] (3)用分析天平稱取100mg樣品，加入400yLAPI緩沖液以及4yL的RNaseA， 劇烈震蕩混勻后，65°C下水浴20min，期間震