基于kasp技術(shù)檢測小麥功能基因的成套引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基于KASP技術(shù)檢測小麥功能基因的成套 引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，基于DNA序列多態(tài)性的分子標(biāo)記受到國內(nèi)外育種家的高度重視。利用與 目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行選擇，不受環(huán)境影響，選擇結(jié)果可靠，而且在聚合有利性 狀時，可以在回交滲透過程中通過遺傳背景選擇，減少連鎖累贅，加速育種進(jìn)程。因此，通過 現(xiàn)代分子生物學(xué)手段開發(fā)控制小麥重要性狀的分子標(biāo)記，對我國小麥育種具有重要意義。
[0003] 迄今為止，小麥遺傳育種中常用的分子標(biāo)記有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、STS、CAPS、DArT、SCAR和SNP。隨著小麥基因的克隆，基于小麥功能基因開發(fā)的功能標(biāo)記也逐漸得到應(yīng) 用。在小麥中，幾十個重要性狀的基因已經(jīng)克隆，其相應(yīng)的功能標(biāo)記為育種家向新品種導(dǎo)入 有利基因提供了方便，通過目標(biāo)選擇，并結(jié)合感興趣性狀的功能基因的有利等位變異，提尚 了選擇效率，縮短了育種年限。Zhang等（2014)根據(jù)控制水稻籽粒大小的基因0sGS3同源 克隆了小麥TaGS-Dl基因，并據(jù)此開發(fā)了功能標(biāo)記GS7D，經(jīng)連鎖分析發(fā)現(xiàn)與小麥千粒重有 顯著的相關(guān)性，應(yīng)用于篩選千粒重較高的品種。Jiang等（2015)克隆了 0sGIF(0sCWI2)在 小麥中的同源基因TaCWI-4A，開發(fā)了caps4A標(biāo)記，用于選擇千粒重較高和穗粒數(shù)較多的品 種。He等（2009)和Wang等（2009)分別開發(fā)了黃色素合成途徑中八氫番茄紅素合成酶基 因Psy-Bl的功能標(biāo)記YP7B-1、YP7B-2、YP7B-3 和Psyl-Dl的功能標(biāo)記YP7D-1、YP7D-2,與 小麥籽粒中的黃色素含量顯著相關(guān)，可以通過檢測該酶的等位基因型篩選黃色素含量較高 (=類胡蘿卜素含量較高）、營養(yǎng)價值較好的品種，省去了做成品的步驟，方便了育種家選 擇優(yōu)質(zhì)品種。所以，利用功能標(biāo)記檢測不同小麥品種功能基因的等位基因型，給育種家輔助 選擇品種提供了很大幫助。
[0004] 盡管這些功能標(biāo)記在小麥功能基因檢測方面已得到部分應(yīng)用，但操作過程繁瑣復(fù) 雜，需要酶切、電泳，檢測效率低。在育種過程中育種家篩選大量后代材料，需要較高成本和 較長時間，此方法難以滿足生產(chǎn)需要。因此，建立一種快速、高效、便捷檢測不同小麥品種功 能基因的方法非常必要。
[0005] KASP技術(shù)（即競爭性等位基因特異性PCR)是目前國際上主流的基因分型方法之 一，基于引物末端堿基的特異匹配來對SNP和特定位點上的InDel進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因 判斷。引物采用3條特異性引物，其中上游引物2條，3'端為等位變異堿基，5'端添加通 用熒光接頭序列，下游引物為普通引物，常規(guī)PCR擴(kuò)增，終點法熒光信號檢測。該技術(shù)準(zhǔn)確 率高，靈活性超強(qiáng)，無需昂貴的雙色標(biāo)記探針，最低的DNA樣本需求，無需全基因組擴(kuò)增，快 速高效，可以高通量檢測大量樣本的少數(shù)幾個標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測小麥功能基因的成套KASP引物。
[0007] 本發(fā)明提供了一種用于檢測小麥功能基因的成套KASP引物，其中所述小麥功 能基因為Pp〇-Dl基因、TaPod-Al基因、TaCKX6-Dl基因、TaCWl-4A基因、TaGS-Dl基因、 TaGASR7-Al基因、1-FEHw3 基因、Pinb2-v2 基因、Psy-Bl基因、Psyl-Dl基因、TaZds-Al基 因、Talyce-Bl基因、TaPds-Bl基因、Glu-Bl基因，所述成套KASP引物具體由如下（1) - (14) 組成：
[0008] (1)特異于所述Ppo-Dl基因的KASP引物：引物1、引物2和引物3;所述引物1為 自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列A和序列表中序列1的第22-41位的單鏈DNA;所述引物2 為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列B和序列表中序列2的第22-41位的單鏈DNA;所述引 物3為核苷酸序列如序列表中序列3所示的單鏈DNA;
[0009] (2)特異于所述TaPod-Al基因的KASP引物：引物4、引物5和引物6;所述引物4 為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列A和序列表中序列4的第22-42位的單鏈DNA;所述引 物5為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列B和序列表中序列5的第22-42位的單鏈DNA;所 述引物6為核苷酸序列如序列表中序列6所示的單鏈DNA;
[0010] ⑶特異于所述TaCKX6-Dl基因的KASP引物：引物7、引物8和引物9 ;所述引物 7為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列A和序列表中序列7的第22-44位的單鏈DNA;所述引 物8為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列B和序列表中序列8的第22-39位的單鏈DNA;所 述引物9為核苷酸序列如序列表中序列9所示的單鏈DNA;
[0011] ⑷特異于所述TaCWl-4A基因的KASP引物：引物10、引物11和引物12 ;所述引 物10為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列A和序列表中序列10的第22-53位的單鏈DNA; 所述引物11為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列B和序列表中序列11的第22-53位的單鏈 DNA;所述引物12為核苷酸序列如序列表中序列12所示的單鏈DNA;
[0012](5)特異于所述TaGS-D1基因的KASP引物：引物13、引物14和引物15 ;所述引物 13為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列A和序列表中序列13的第22-42位的單鏈DNA;所述 引物14為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列B和序列表中序列14的第22-42位的單鏈DNA; 所述引物15為核苷酸序列如序列表中序列15所示的單鏈DNA;
[0013] (6)特異于所述TaGASR7-Al基因的KASP引物：引物16、引物17和引物18;所述 引物16為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列A和序列表中序列16的第22-41位的單鏈DNA; 所述引物17為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列B和序列表中序列17的第22-41位的單鏈 DNA;所述引物18為核苷酸序列如序列表中序列18所示的單鏈DNA;
[0014] (7)特異于所述1-FEHw3基因的KASP引物：引物19、引物20和引物21;所述引 物19為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列A和序列表中序列19的第22-41位的單鏈DNA; 所述引物20為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列B和序列表中序列20的第22-41位的單鏈 DNA;所述引物21為核苷酸序列如序列表中序列21所示的單鏈DNA;
[0015] (8)特異于所述Pinb2-v2基因的KASP引物：引物22、引物23和引物24;所述引 物22為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列A和序列表中序列22的第22-46位的單鏈DNA; 所述引物23為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列B和序列表中序列23的第22-48位的單鏈 DNA;所述引物24為核苷酸序列如序列表中序列24所示的單鏈DNA;
[0016] (9)特異于所述Psy-Bl基因的KASP引物：引物25、引物26和引物27;所述引物 25為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列A和序列表中序列25的第22-41位的單鏈DNA;所述 引物26為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列B和序列表中序列26的第22-41位的單鏈DNA; 所述引物27為核苷酸序列如序列表中序列27所示的單鏈DNA;
[0017] (10)特異于所述Psyl-Dl基因的KASP引物：引物28、引物29和引物30 ;所述引 物28為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列A和序列表中序列28的第22-46位的單鏈DNA; 所述引物29為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列B和序列表中序列29的第22-47位的單鏈 DNA;所述引物30為核苷酸序列如序列表中序列30所示的單鏈DNA;
[0018] (11)特異于所述TaZds-Al基因的KASP引物：引物31、引物32和引物33 ;所述引 物31為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列A和序列表中序列31的第22-42位的單鏈DNA; 所述引物32為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列B和序列表中序列32的第22-42位的單鏈 DNA;所述引物33為核苷酸序列如序列表中序列33所示的單鏈DNA;
[0019] (12)特異于所述Talyce-Bl基因的KASP引物：引物34、引物35和引物36 ;所述 引物34為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列A和序列表中序列34的第22-46位的單鏈DNA; 所述引物35為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列B和序列表中序列35的第22-46位的單鏈 DNA;所述引物36為核苷酸序列如序列表中序列36所示的單鏈DNA;
[0020] (13)特異于所述TaPds-Bl基因的KASP引物：引物37、引物38和引物39 ;所述引 物37為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列A和序列表中序列37的第22-46位的單鏈DNA; 所述引物38為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列B和序列表中序列38的第22-46位的單鏈 DNA;所述引物39為核苷酸序列如序列表中序列39所示的單鏈DNA;
[0021] (14)特異于所述Glu-Bl基因的KASP引物：引物40、引物41和引物42 ;所述引物 40為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列A和序列表中序列40的第22-45位的單鏈DNA;所述 引物41為自5'端到3'端依次為標(biāo)簽序列B和序列表中序列41的第22-45位的單鏈DNA; 所述引物42為核苷酸序列如序列表中序列42所示的單鏈DNA。
[0022] 進(jìn)一步，所述標(biāo)簽序列A的核苷酸序列為序列表中序列1的第1-21位；所述標(biāo)簽 序列B的核苷酸序列為序列表中序列2的第1-21位。
[0023] 更加具體的，所述引物1為核苷酸序列如序列表中序列1所示的單鏈DNA;所述引 物2為核苷酸序列如序列表中序列2所示的單鏈DNA;所述引物4為核苷酸序列如序列表 中序列4所示的單鏈DNA;所述引物5為核苷酸序列如序列表中序列5所示的單鏈DNA;所 述引物7為核苷酸序列如序列表中序列7所示的單鏈DNA;所述引物8為核苷酸序列如序 列表中序列8所示的單鏈DNA;所述引物10為核苷酸序列如序列表中序列10所示的單鏈 DNA;所述引物11為核苷酸序列如序列表中序列11所示的單鏈DNA;所述引物13為核苷酸 序列如序列表中序列13所示的單鏈DNA;所述引物14為核苷酸序列如序列表中序列14所 示的單鏈DNA;所述引物16為核苷酸序列如序列表中序列16所示的單鏈DNA;所述引物17 為核苷酸序列如序列表中序列17所示的單鏈DNA;所述引物19為核苷酸序列如序列表中 序列19所示的單鏈DNA;所述引物20為核苷酸序列如序列表中序列20所示的單鏈DNA;所 述引物22為核苷酸序列如序列表中序列22所示的單鏈DNA;所述引物23為核苷酸序列如 序列表中序列23所示的單鏈DNA;所述引物25為核苷酸序列如序列表中序列25所示的單 鏈DNA;所述引物26為核苷酸序列如序列表中序列26所示的單鏈DNA;所述引物28為核苷 酸序列如序列表中序列28所示的單鏈DNA;所述引物29為核苷酸序列如序列表中序列29 所示的單鏈DNA;所述引物31為核苷酸序列如序列表中序列31所示的單鏈DNA;所述引物 32為核苷酸序列如序列表中序列32所示的單鏈DNA ;所述引物34為核苷酸序列如序列表 中序列34所示的單鏈DNA ;所述引物35為核苷酸序列如序列表中序列35 ;所述引物37為 核苷酸序列如序列表中序列37所示的單鏈DNA ;所述引物38為核苷酸序列如序列表中序 列38所示的單鏈DNA ;所述引物40為核苷酸序列如序列表中序列40所示的單鏈DNA ;所述 引物41為核苷酸序列如序列表中序列41所示的單鏈DNA ;
[0024] 上述（1)-(14)共14個KASP引物為分別單獨包裝。
[0025] 本發(fā)明所提供的用于檢測小麥功能基因的成套KASP引物，也可以為下述（a)或 (b)：
[0026] (a)由來自于上述（1)中的所述KASP引物，以及來自于上述（2)_所述（14)中的 任意N個所述KASP引物組成；所述N為1-13的整數(shù)；
[0027] (b)上述（1)中的所述KASP引物。
[0028] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于檢測小麥功能基因的試劑盒。
[0029] 本發(fā)明所提供的用于檢測小麥功能基因的試劑盒，含有所述成套KASP引物。
[0030] 所述試劑盒中還可含有熒光探針A、熒光探針B、淬滅探針A淬滅探針B;
[0031] 所述熒光探針A為與所述標(biāo)簽序列A-致的序列，5'末端連接1個熒光基團(tuán)A;所 述淬滅探針A為所述標(biāo)簽序列A的反向互補序列，3'末端連接淬滅基團(tuán)；
[0032] 所述熒光探針B為與所述標(biāo)簽序列B-致的序列，5'末端連接1個熒光基團(tuán)B;所 述淬滅探針B為所述標(biāo)簽序列B的反向互補序列，3'末端連接淬滅基團(tuán)。
[0033] 在本發(fā)明中，所述熒光報告基團(tuán)A為FAM;所述熒光報告基團(tuán)B為HEX;所述熒光淬 滅基團(tuán)為BHQ。
[0034] 在本發(fā)明中，所述熒光探針A、所述熒光探針B、所述淬滅探針A和所述淬滅探針B 是存在于KASP 2XMaster Mix中的，其中所述KASP 2XMaster Mix為英國LGC公司產(chǎn)品， 其產(chǎn)品目錄號為KBS-1016-002。
[0035] 所述試劑盒中還含有MgCljP ddH20,其中所述MgCl2為英國LGC公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品 目錄號為10364672,所述ddH20為高壓滅菌的雙蒸水。
[0036] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種檢測或輔助檢測小麥功能基因的基因型的方法。
[0037] 本發(fā)明提供了檢測或輔助檢測小麥功能基因的基因型的方法，其中所述小麥功能 基因為Pp〇-Dl基因和如下中的至少一種：TaPod-Al基因、TaCKX6-Dl基因、TaCWl-4A基因、 TaGS-Dl基因、TaGASR7-Al基因、1-FEHw3 基因、Pinb2-v2 基因、Psy-Bl基因、Psyl-Dl基 因、TaZds-Al基因、Talyce-Bl基因、TaPds-Bl基因、Glu-Bl基因，所述方法具體為如下（A) 或（B):
[0038]⑷由如下（al)，以及如下（a2)-(al4)這13種中的至少一種組成：
[0039] (B)為如下（al);
[0040] (al)檢測或輔助檢測待測小麥的Ppo-Dl基因的基因型的方法，包括如下步驟：以 所述待測小麥的基因組DNA為模板，采用所述試劑盒（所述熒光報告基團(tuán)A為FAM ;所述 熒光報告基團(tuán)B為HEX)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號掃描，采用Kluster Caller軟件對掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果按照如下確定所述待測小麥的Ppo-Dl基 因的基因型：若所述待測小麥的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號數(shù)據(jù)經(jīng)KlusterCaller軟件分析呈 現(xiàn)藍(lán)色，則所述待測小麥的Ppo-Dl基因的基因型為GG;若所述待測小麥的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光 信號數(shù)據(jù)經(jīng)KlusterCaller軟件分析呈現(xiàn)紅色，則所述待測小麥的Ppo-Dl基因的基因型 為CC;若所述待測小麥的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號數(shù)據(jù)經(jīng)KlusterCaller軟件分析呈現(xiàn)綠色， 則所述待測小麥的Pp〇-Dl基因的基因型為CG;
[0041] (a2)檢測或輔助檢測待測小麥的