運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的易錯(cuò)全基因組改組方法及耐受糠醛運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種運(yùn)用易錯(cuò)全基因組改組技術(shù)提高運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的糠醛耐受性的方法及耐受糠醛運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著化石能源的日益枯竭，溫室效應(yīng)的逐步顯現(xiàn)，清潔可替代能源已成為全球的研究熱點(diǎn)，以木質(zhì)纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的研發(fā)工作更是備受關(guān)注。自然界中可再生的木質(zhì)纖維素資源極為豐富，其主要成份是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。釀酒酵母和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)作為生產(chǎn)乙醇的菌株而備受關(guān)注。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌是目前唯一一種通過(guò)ED途徑厭氧發(fā)酵葡萄糖的微生物，與釀酒酵母相比具有糖吸收比速率快、乙醇得率高、生物量形成少等產(chǎn)醇優(yōu)勢(shì)[1]，可作為工業(yè)化生產(chǎn)乙醇的優(yōu)勢(shì)菌株。木質(zhì)纖維素難于降解，需要物理、化學(xué)等預(yù)處理手段打破纖維素微纖維之間的交聯(lián)耦合。在預(yù)處理過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生三類抑制酶解和發(fā)酵的抑制物:1.弱酸(乙酸、甲酸和乙酰丙酸)等；
2.木質(zhì)素降解產(chǎn)物(酚醛樹(shù)脂、香草醛和木質(zhì)素單體等)；3.糖的熱降解過(guò)程中，由于焦糖化作用和美拉德反應(yīng)而產(chǎn)生的糠醛和5-羥甲基糠醛等熱降解產(chǎn)物[2]?？啡?、5-羥甲基糠醛等發(fā)酵抑制物，抑制菌體生長(zhǎng)和微生物發(fā)酵，從而降低乙醇效率M。構(gòu)建能耐受木質(zhì)纖維素水解液中抑制物的工程菌株可以使菌株在水解液中高效發(fā)酵，降低預(yù)處理過(guò)程中工藝水洗抑制物的用量，節(jié)約生產(chǎn)成本，對(duì)纖維素乙醇的工業(yè)化具有重要意義。
[0003]目前發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的hfq(ZM00347)基因在抵抗多種木質(zhì)纖維素預(yù)處理抑制劑(乙酸甲酯，香草醛，糠醛和羥甲基糠醛)中發(fā)揮作用，在hfq的突變株中過(guò)表達(dá)該基因能恢復(fù)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的糠醛耐受性M。但是轉(zhuǎn)錄組的研究也表明細(xì)菌呈現(xiàn)環(huán)境脅迫，酸、酚和糠醛等水解抑制物脅迫時(shí)，多基因表達(dá)發(fā)生改變。即多基因表達(dá)水平同時(shí)改變更有利于細(xì)菌獲得耐受性能[5]。然而，目前對(duì)細(xì)菌的耐受脅迫機(jī)制研究尚不清楚。一些學(xué)者也利用基因工程、適應(yīng)性培養(yǎng)、誘變等手段實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)改變以有效的提高細(xì)菌的耐脅迫性[6]，但獲得的耐受水解液抑制物的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌較少。傳統(tǒng)的易錯(cuò)PCR技術(shù)只能對(duì)特定的基因進(jìn)行有效突變，而全基因組改組技術(shù)需要結(jié)合理化誘變獲得優(yōu)良菌株進(jìn)而通過(guò)原生質(zhì)體融合而實(shí)現(xiàn)各菌株全基因的洗牌，從而篩選出耐受性狀提高的菌[7]。理化誘變篩選菌的方法對(duì)操作人員有一定的危害、適應(yīng)進(jìn)化也費(fèi)時(shí)費(fèi)力；運(yùn)用分子生物學(xué)手段對(duì)某一或某幾個(gè)特定基因過(guò)表達(dá)或敲除難以多方位改造菌的特性、大幅度提高其耐受性，運(yùn)用合成生物學(xué)手段系統(tǒng)的實(shí)現(xiàn)多基因改造以改善菌的耐受性需要對(duì)機(jī)制有充分的理解。因而，目前急需建立快速有效的手段獲得具有耐受性的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，以提高其在木質(zhì)纖維素水解液中的應(yīng)用能力。
[0004]參考文獻(xiàn):
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[0011]7.羅劍，楊民和，施巧琴.微生物菌種選育中的基因組改組技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)展生物技術(shù) 2008, 81-83.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的易錯(cuò)全基因組改組方法。
[0013]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供耐受糠醛運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。
[0014]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0015]運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的易錯(cuò)全基因組改組方法，包括如下步驟:
[0016](I)基因組DNA提取:提取出發(fā)菌株運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的基因組DNA ;
[0017](2)易錯(cuò)PCR擴(kuò)增全基因組:
[0018]取5 μ L的dNTPS母液、16.6 μ L的100uM10-17個(gè)堿基的隨機(jī)引物、3 μ L的15mM的MnCl2、5yL 的 1X 突變 buffer、20ng 步驟(I)獲得的基因組 DNA、2.5 μ L 的 2U/μ L TaqDNA聚合酶、補(bǔ)充無(wú)菌水至50 μ L ;所述dNTPS母液含1mM dCTP和dTTP、2mM dATP和dGTP ；所述 1X 突變 buffer 含 ImM ρΗ8.3 的 Tris-HCl，0.7mM MgCl2、5mM KC1、lg/100mL 甘油；
[0019]易錯(cuò)PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性5分鐘；92°C lmin，再在37°C的條件下退火lmin，再由37°C以每秒變化0.1°(:的速度升至55°(:，55°(:延伸4min，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)，55°C補(bǔ)充延伸 1min ；
[0020](3)全基因組改組:將步驟⑵獲得的PCR產(chǎn)物通過(guò)乙醇沉淀濃縮10倍；制備出發(fā)菌株運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的感受態(tài)細(xì)胞；取濃縮后的PCR產(chǎn)物3-5 μ L至50ul所述運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的感受態(tài)細(xì)胞，1800V電擊后加入RM液體培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中于30°C靜置培養(yǎng)12-17小時(shí)，涂布于糠醛濃度為l_3g/L的RM固體培養(yǎng)基篩選平板，倒置放于培養(yǎng)箱30°C培養(yǎng)2-5天，得到單克隆，即轉(zhuǎn)化子；
[0021](4)評(píng)價(jià):挑取步驟(3)所述單克隆至RM液體培養(yǎng)基中于靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)晚期，保存菌液；分別接種上述單克隆的菌液和出發(fā)菌株運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌至RM液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD6。。為1.2-1.6 ;再分別轉(zhuǎn)接至糠醛濃度為3g/L的含糠醛的RM液體培養(yǎng)基使各個(gè)菌株的初始接種濃度一致，測(cè)定生長(zhǎng)曲線，篩選出耐糠醛的轉(zhuǎn)化子。
[0022]耐受糠醛運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，其分類命名為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌F2.5-4 (Zymomonasmobilis)F2.5-4，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC NO:M2015366。
[0023]本發(fā)明的方法獲得的耐受糠醛的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，能在3g/L糠醛的RM培養(yǎng)基中高效的生長(zhǎng)。與傳統(tǒng)的全基因組改組技術(shù)相比，本發(fā)明有效地運(yùn)用易錯(cuò)PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)無(wú)需理化誘變和原生質(zhì)體融合即能快速有效獲得耐受糠醛的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在糠醛濃度為3g/L的培養(yǎng)基中出發(fā)菌株運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，而本發(fā)明的方法獲得的耐受糠醛的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌比出發(fā)菌株運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌耐受糠醛能力強(qiáng)。
[0024]本發(fā)明采用全基因組改組技術(shù)能高效地獲得耐受糠醛的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，比適應(yīng)性馴化的方法效率高，時(shí)間短；與傳統(tǒng)的基因組改組的方法比，無(wú)需原生質(zhì)體融合和誘變、所使用的試劑安全環(huán)保，操作快捷高效。因此本發(fā)明的菌株和方法對(duì)有效的利用廢棄的木質(zhì)纖維素生產(chǎn)清潔能源、解決當(dāng)前能源危機(jī)具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4的基因組DNA及易錯(cuò)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道I和2分別為純化和粗提的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4的基因組DNA，M為marker，泳道3_8為實(shí)施例2中用12-17bp的隨機(jī)引物獲得的5 μ I的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物電泳圖。
[0026]圖2為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4和實(shí)施例3獲得的單克隆在糠醛濃度為3g/L的RM液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)發(fā)酵比較。
[0027]圖3為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4和實(shí)施例4篩選出的耐受糠醛的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌F2.5-4在糠醛濃度為lg/L RM固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況。
[0028]圖4是實(shí)施例4篩選出的耐受糠醛的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌F2.5-4和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4在葡萄糖質(zhì)量濃度為2%和4%、糠醛濃度為3g/L的RM液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。
[0029]生物材料樣品保藏
[0030]本發(fā)明涉及的耐受糠醛運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，其分類命名為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌F2.5-4 (Zymomonas mobilis) F2.5_4，該菌株已于2015年6月12日保藏于地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)CCTCC NO:M2015366o
【具體實(shí)施方式】
[0031]本發(fā)明以保藏號(hào)為CICC 10232的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4為出發(fā)菌株，是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行限制，采用其它的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌為出發(fā)菌株，也可以用于本發(fā)明。
[0032]保藏號(hào)為CICC 10232的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4購(gòu)自于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(簡(jiǎn)稱運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4)。
[0033]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0034]實(shí)施例1基因組DNA提取:
[0035]提取出發(fā)菌株運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4的基因組DNA，(圖1)，具體操作如下:甘油管中的上述菌液轉(zhuǎn)接至含有5mL的RM液體培養(yǎng)基的試管中，30 °C培養(yǎng)過(guò)夜，使0D600 = 2?4。將培養(yǎng)物移至離心管中，4°C 13000rpm離心I分鐘后棄上清，沉淀用30yL無(wú)菌水重懸后，離心棄上清。在離心管內(nèi)加入120 μ L破菌緩沖液、60 μ L Tris飽和酸、60 μ L氯仿、120 μ LTE緩沖液，120 μ L體積石英砂，充分震蕩4min后，4°C 13000rpm/5min離心取上清液。在上清液中加入ImL無(wú)水乙醇，顛倒混勾，于-20°C放置30min后，于4°C，13000rpm/25min離心，棄上清液，沉淀晾干，取50 μ L無(wú)菌水重懸得到基因組DNA。
[0036]RM液體培養(yǎng)基為:20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物和KH2P042g/L，余量為水；