靶向人KPNB1基因的siRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥及基因治療領(lǐng)域，具體涉及一種靶向人KPNB1基因的SiRNA 及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] KPNB1全稱是Karyopherin(importin)beta1，即轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白0 1 (輸入蛋白 0 1)。核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白importing家族成員在核蛋白的輸入過程中起到了重要的作 用外，還具有其它重要的生物學(xué)功能，如在沿微管的運(yùn)動(dòng)中起到了潛在的馬達(dá)調(diào)節(jié)蛋白 的作用，參與紡錘體的裝配、中心體的動(dòng)力學(xué)、核膜的裝配、核孔的裝配以及將損傷信號(hào) 從受損軸突到細(xì)胞體的轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。（WANGShan等，IdentificationofInteraction betweenMARVELDlandImportingIChineseJournalofBiochemistryandMolecular Biolog，2009May;25(8) :735 ~739)。
[0003]人KPNB1 基因位于 17 號(hào)染色體，mRNA(GenebankAccession:NM_002265. 5)。 當(dāng)前研究表KNPB1能把多種蛋白質(zhì)運(yùn)入核，一個(gè)是死亡受體DR5(DeathRec印tor)， 從而抑制DR5/TRAIL引起的凋亡。（KojimaY.etc;Importin01P;roteinmediated nuclearlocalizationofdeathreceptor5(DR5)limitsDR5tumornecrosis factor(TNF)-relatedapoptosis-inducingligand(TRAIL)-inducedcelldeath ofhumantumorcells；JBiolChem,2011Dec16 ；286 (50):43383-93.)； 一 個(gè) 是ErbB2(ReceptortyrosineproteinkinaseerbB-2)，而ErbB2 與多種腫瘤包 括膠質(zhì)瘤相關(guān)(DipakK,Giri.EndosomalTransportofErbB-2:Mechanismfor NuclearEntryoftheCellSurfaceReceptor.MOLECULARANDCELLULARBIOLOGY; Dec. 2005,p.11005 - 11018) ;KNPB1 受E2F調(diào)節(jié)，與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)（VanderWattPJ etc.OverexpressionofKpn0landKpna2importinproteinsincancerderivesfrom deregulatedE2Factivity.PlosOne. 2011 ;6(ll)e27723);還有EzH2-miR-30d-KPNBl 通路對(duì)惡性外周神經(jīng)鞘瘤（MPNSTs)的作用（PingyuZhang,etc,EZH2 -miR_30d-KPNBlpathwayregulatesmalignantperipheralnervesheathtumourcellsurvival andtumourigenesis.JournalofPathology. 2014;232:308 - 318)。
[0004] 腫瘤是威脅人類健康的疾病之一，至今缺少理想的治療手段和藥物，開發(fā)新的藥 物迫在眉睫?；蛑委熓欠浅Ｓ星熬暗?，在不久的將來或許會(huì)成為腫瘤治療的一個(gè)有效手 段。RNA干擾技術(shù)是一種沉默基因表達(dá)的技術(shù)，兩名美國科學(xué)家AndrewZ.Fire和Craig C.Mello因?qū)Υ隧?xiàng)技術(shù)的貢獻(xiàn)于2006年被授予諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)。RNA干擾技術(shù)的原理是較 長雙鏈RNA被特異核酸酶Dicer切割加工成21-23nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA。 小干擾RNA隨后形成沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)解旋成單鏈。 反義鏈引導(dǎo)該沉默復(fù)合體通過堿基配對(duì)特異性結(jié)合到目標(biāo)mRNA上，使mRNA分解。
[0005] 發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA，shRNA)是一種形成急轉(zhuǎn)彎結(jié)構(gòu)的RNA序列，可以經(jīng) 由RNA干擾使基因沉默。
[0006] 膠質(zhì)瘤是一種發(fā)生于腦或脊髓的腫瘤，最常發(fā)生部位為腦，因其來源神經(jīng)膠質(zhì)細(xì) 胞而被稱為膠質(zhì)瘤。膠質(zhì)瘤占腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%、占腦惡性腦腫瘤的80%，是 人類健康的嚴(yán)重威脅。腦膠質(zhì)瘤的治療通常采用手術(shù)，放療和化療相結(jié)合。膠質(zhì)瘤常發(fā)生 于腦，手術(shù)需要開顱，手術(shù)時(shí)間長。膠質(zhì)瘤和正常神經(jīng)組織交錯(cuò)生長，邊界不清，瘤組織不易 清理干凈，膠質(zhì)瘤易復(fù)發(fā)。對(duì)于化療，由于血腦屏障的存在，使普通的抗腫瘤藥物療效不佳。 對(duì)于放療，也存在定位困難和對(duì)神經(jīng)損傷的擔(dān)心。目前膠質(zhì)瘤仍是醫(yī)學(xué)界的一個(gè)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供了一種靶向人KPNB1基因的siRNA，本發(fā)明的另一目的在 于提供該siRNA在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明人經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明惡性程度較高的膠質(zhì)瘤，KPNB1的表達(dá)量也較高，調(diào)節(jié)KPNB1 的表達(dá)能影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。
[0009] 本發(fā)明結(jié)合KPNB1分子在瘤細(xì)胞中的功能，利用RNA干擾技術(shù)開發(fā)新的治療藥物。
[0010] 本發(fā)明設(shè)計(jì)靶向KPNB1基因的siRNA，特異性抑制KPNB1基因的表達(dá)，從而抑制膠 質(zhì)瘤的增殖。進(jìn)一步地本發(fā)明提供了包含該siRNA的shRNA分子，也具有抑制KPNB1的表 達(dá)的作用，可能成為治療膠質(zhì)瘤的藥物。
[0011] 本發(fā)明的第一方面，是提供一種靶向人KPNB1基因，并特異性抑制KPNB1基因表達(dá) 的siRNA或shRNA。
[0012] 本發(fā)明提供了三種靶向人KPNB1基因并特異性抑制KPNB1基因表達(dá)的siRNA，包括 正義鏈和反義鏈，siRNA的序列如下：
[0013]siRNA-1：
[0014]正義鏈：5' -GCUUGCUAUUGAUGCUAAUGC-3'（SEQIDNO. 1)
[0015]反義鏈：5, -CGAACGAUAACUACGAUUACG-3,（SEQIDNO. 2)
[0016]siRNA-2:
[0017]正義鏈：5' -GGAAGUGUUGGGUGGUGAAUU-3'（SEQIDNO. 3)
[0018]反義鏈：5, -CCUUCACAACCCACCACUUAA-3,（SEQIDNO. 4)
[0019]siRNA-3：
[0020] 正義鏈：5' -GGUGGACAA⑶CAGACUAUGA-3'（SEQIDNO. 5)
[0021] 反義鏈：5, -CCACCUGUUCA⑶CUGAUACU-3,（SEQIDNO. 6)
[0022] 本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，siRNA-2、siRNA-3的干擾效果最好。
[0023] 本發(fā)明提供了一種上述的siRNA序列的shRNA序列，包括正義鏈和反義鏈，shRNA 序列為：
[0024]shRNA-1：
[0025] 正義鏈：
[0026] 5'-
[0027]CCGGGCUUGCUAUUGAUGCUAAUGCCUCGAGGCAUUAGCAUCAAUAGCAAGCUUUUUUG-3,（SEQID NO. 7)
[0028] 反義鏈：
[0029] 5'-
[0030]AAUUCAAAAAAGCUUGCUAUUGAUGCUAAUGCCUCGAGGCAUUAGCAUCAAUAGCAAGC-3'（SEQID NO. 8)
[0031] shRNA-2：
[0032] 正義鏈：
[0033] 5' -
[0034]CCGGGGAAGUGUUGGGUGGUGAAUUCUCGAGAAUUCACCACCCAACACUUCCUUUUUUG-3,（SEQID NO. 9)
[0035] 反義鏈：
[0036] 5' -
[0037]AAUUCAAAAAAGGAAGUGUUGGGUGGUGAAUUCUCGAGAAUUCACCACCCAACACUUCC-3,（SEQID NO. 10)
[0038] ShRNA-3：
[0039] 正義鏈：
[0040] 5' -
[0041]CCGGGGUGGACAAGUCAGACUAUGACUCGAGUCAUAGUCUGACUUGUCCACCUUUUUUG-3,（SEQID NO. 11)
[0042] 反義鏈：
[0043] 5' -
[0044]AAUUCAAAAAAGGUGGACAAGUCAGACUAUGACUCGAGUCAUAGUCUGACUUGUCCACC-3,（SEQID NO. 12)
[0045] 本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，shRNA-2、shRNA-3的干擾效果最好。
[0046] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)錄上述的shRNA的DNA序列，DNA序列為：
[0047]ShRNA-1 ：
[0048] 轉(zhuǎn)錄正義鏈的DNA:
[0049] 5' -
[0050]CCGGGCTTGCTATTGATGCTAATGCCTCGAGGCATTAGCATCAATAGCAAGCTTTTTTG-3'（SEQID NO. 13)
[0051] 轉(zhuǎn)錄反義鏈的DNA:
[0052] 5' -
[0053]AATTCAAAAAAGCTTGCTATTGATGCTAATGCCTCGAGGCATTAGCATCAATAGCAAGC-3'（SEQID NO. 14)
[0054]ShRNA-2:
[0055] 轉(zhuǎn)錄正義鏈的DNA:
[0056] 5' -
[0057]CCGGGGAAGTGTTGGGTGGTGAATTCTCGAGAATTCACCACCCAACACTTCCTTTTTTG-3'（SEQID NO. 15)
[0058] 轉(zhuǎn)錄反義鏈的DNA:
[0059] 5' -
[0060]AATTCAAAAAAGGAAGTGTTGGGTGGTGAATTCT