正調(diào)控花色苷合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子的cDNA序列的制作方法
【專利說明】正調(diào)控花色苷合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子的cDNA序列
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于植物分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及紅花香雪蘭花瓣分離得到的兩個(gè)具有功能的，與花朵花色苷合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子和FhPAPm的CDNA序列及其氨基酸序列。
【背景技術(shù)】
[0003]影響植物顏色的主要有三大類色素:花色苷、類胡蘿卜素和甜菜素。人們對(duì)于花色苷的研究抱有極大的興趣，這源于其對(duì)植物生理和人類健康起著非常重要的作用?；ㄉ帐怯梢幌盗忻复呋铣?，這些酶則由相對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)基因控制，研究表明:這些結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)由一個(gè)復(fù)雜轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，其中MYB轉(zhuǎn)錄因子是MBW(MYB-bHLH-WDR)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的重要成員，它發(fā)揮著特異性調(diào)節(jié)的作用。植物MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是一個(gè)具有不同調(diào)控功能的大家族，它們對(duì)于激活特定的下游基因的表達(dá)發(fā)揮重要作用。根據(jù)MYB蛋白保守結(jié)構(gòu)域的不同，MYB可以分為R2R3 MYB和R3 MYB等。
[0004]到目前為止，人們已經(jīng)在很多植物中克隆得到正調(diào)控花色苷合成的R2R3 MYBJn金魚草，擬南芥，甘藍(lán)，辣椒，甜橙，淫羊藿，山竹，龍膽，非洲菊，甘薯，牽牛，蘋果，苜蓿，楊梅，煙草，矮牽牛，西洋梨，沙梨，碧桃，番茄，馬鈴薯和葡萄等，但是這些都屬于雙子葉植物，在單子葉中只有從百合，蝴蝶蘭和玉米中克隆得到了花色苷合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明中涉及到的FhPAPlLl取因是從單子葉植物香雪蘭中克隆得到的，編碼與植物花色苷合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，具體說該基因是正調(diào)控植物花色形成的轉(zhuǎn)錄因子，能促進(jìn)花色苷的合成，與花色行成密切相關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明首次從紅花香雪蘭花瓣中克隆得到兩條正調(diào)控花色苷合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子{FhPAPlLl取FhPAPlL^的cDNA序列，并推測(cè)得到了其編碼的氨基序列。在擬南芥和煙草中過量表達(dá)FhPAPILI取之可以明顯地增強(qiáng)植物組織的著色，從而確定其參與正調(diào)控植物花色苷合成的功能。
[0006]本發(fā)明的主要目的是提供已經(jīng)得到功能驗(yàn)證的編碼FhPAPlLl取FhPAPlLM] cDNA序列和由此推斷的氨基酸序列。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:
為了從首次從香雪蘭中克隆得到FhPAPlLl取因，本發(fā)明人首先利用擬南芥中PAPl序列作為誘餌，對(duì)實(shí)驗(yàn)室已建立的紅花香雪蘭花朵盛開時(shí)期轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行本地Blast，篩選與擬南芥中同源性較高的序列。分離得到了長(zhǎng)度為212bp的FhPAPlLl片啟，分析該序列顯示:此片段與Torenia fournier他R2R3 MYB同源性最高，達(dá)到67%，并且該片段包含ATG起始密碼子，隨后利用RACE法克隆該基因的3’端序列，得到包含TAA終止密碼子的長(zhǎng)度為717bp的片段，此片段與Elaeis guineGiisis^] MYB75_like同源性最高，達(dá)到47%。將上述兩條序列拼接，得到全長(zhǎng)cDNA序列，接著利用紅花香雪蘭花瓣總RNA作為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR，克隆得到929bp的全長(zhǎng)J基因，該基因開放閱讀框架長(zhǎng)702bp，編碼233個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量推測(cè)是27，023 Da，等電點(diǎn)為6.23。序列分析表明:此基因與的MYB75_lke同源性最高，達(dá)到52%。另外，我們還分離到了長(zhǎng)度為755bp的片段，序列分析顯示:該片段包含ATG起始密碼子和TAA終止密碼子。提取紅花香雪蘭花瓣總RNA作為模板，進(jìn)行RT-PCR，克隆得到755bp的全長(zhǎng)因，開放閱讀框架長(zhǎng)729bp，編碼242個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量推測(cè)是28，076Da，等電點(diǎn)為5.09。序列分析表明:此基因也與Z/aeis的MYB75-1 ike同源性最高，達(dá)到53%。
[0008]利用Gal4_GUS擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體系檢測(cè)了 FhPAPlLl取FhPAPlLM^i錄活性，結(jié)果表明-.FhPAPlLl取FhPAPlL2^是轉(zhuǎn)錄激活子。
[0009]在pZP211雙元表達(dá)載體中插入克隆得到的的FhPAPlLl取FhPAPI因，并且轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌GV3101細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染擬南芥和煙草。
[0010]分別運(yùn)用蘸花法和葉盤法轉(zhuǎn)染擬南芥和煙草，觀察轉(zhuǎn)基因植株表型變化。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因植株花色苷的合成顯著增強(qiáng)，說明香雪蘭中的和因促進(jìn)了花色苷的合成，初步證明我們克隆得到的基因是香雪蘭中正向調(diào)控花色苷合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子。
[0011 ] 香雪蘭FhPAPlLl取因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列信息如下: 其中1:/?/?/5/"基因的全長(zhǎng)核苷酸序列(SEQ ID N0.1)
ATCCAATATTCCTCCCCCTAATGTCTTATCTTGCATGATTCACAATTATGAAACATCAGTACTGCTCCGAGCT
CCGACCTTCGGGCGTTCAGAATCGGAAAGGGGCATGGAACAAAGATGAAGATGAGCTGCTGAGGAAGTGCATTGAAA
AGTATGGAATAGGGAAGTGGAGTACAGTTCCCATGAGGGCAGGACTAAGAAGGTGTCGCAAGAGCTGTCGTCTTCGC
TGGCTGAACTATCTATCCCCTGACATCAACCGAGGAACCTTTAACGACGACGAAGACGACCTCATCCTTCGGCTTCA
CAAGCTCTTGGGCAATAGGTGGTCCCTAATTGCAGGCAGAATCCCCGGCAGGACGGCGAACGACATCAAGAACTACT
GGAACTCTCACTTGGGCAAGAAAGCAGACACCGAGAGAAGGGTACCAGAGAAGACTGACAAGGCTGAGATTGTAAGG
CCACAACCTCAAAGACCGACTTCGACGTGGATTTGGCCGAAGATTAATATTAATCCTCATCAAGAAACTGATCAATT
AGGAACATCTGCCGTGGAGCCAAAACTGCCAACAGTCTTAGAGGAGGAAGAAGCATGGCTGAATGCTTTGATCACCG
ATGATTACAATGAGAATGTGGATGCCGCCTTTTCGGACTTCCATGGCTACGAGATAGGGGGAGGAATATTGGATGAC
ACGCCTTTTTTCGAAGGAGTTACAGGATGGGAGGAACTATACCAGAGAACTGAAAATTAAGTTTAATTTTTCATTGT
TCTAACAATACTGATATCTATATATATATTTTTTTTTTCCTTCGAAGATCAAAGATAGAAAGAAATGAGACCAGTTC
CCCATTGTTGAAAAATAAAGGAATAAGGTTTATGTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCG
ACTCGAGTC
其中2:由/?/?/5/"基因核苷酸序列推測(cè)得到的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID N0.2)MKHQYCSELRPSGVQNRKGAffNKDEDELLRKCIEKYGIGKWSTVPMRAGLRRCRKSCRLRWLNYLSPDINRGTFNDDEDDLILRLHKLLGNRWSLIAGRIPGRTANDIKNYWNSHLGKKADTERRVPEKTDKAEIVRPQPQRPTSTWIffPKININPHQETDQLGTSAVEPKLPTVLEEEEAWLNALITDDYNENVDAAFSDFHGYEIGGGILDDTPFFEGVTGWEELYQRTEN.其中3因的全長(zhǎng)核苷酸序列(SEQ ID N0.3)AATGGATCTCAAAGCTTCAGCCCTTCGAAAAGGCGCATGGAGCAAAGAGGAAGACGACCTGCTAAGGAATTGTATCGATAAGTATGGAGAAGGGAAGTGGAGTTCCGTACCCGAACGTGCAGGGCTTAAAAGGTGTCGAAAGAGCTGTCGACTTAGATGGCTGAACTATCTTTCGCCGAAGATCAACCGAGGCAAGTTTTCGGATGACGAGATCGACCTCCTTATCAGGCTTCACAAGCTTCTAGGGAACAGGTGGTCGCTGATCGCGGGCAGAATCCCCGGTAGGACAGCGAACGACATCAAGAATTATTGGAACTCTCACCTGAGCAAGAGAGTGGAAGCAACAAAATGTAGGAGCAAAACTATAGATGCTCAAGTCGCGAGGCCAAATCCTGAGAGAGATTCCGCCAACTGGAGTTGGCCAACAAATATAGGAACAAATTATGGGAACAACTTGGAAGCAGAAGAAACCGAAATGCCGAAACTACGAACAAGTCAAGAGAATCAGGGAGAACGGTCAAATGATTTGATCATGGAGAATGGTTGGGAAGAGTTGATGCTGCATACTTCTGACGTGAGCTTACAGAATTTTCAGATAGACTTCAAGACACCGGAAATGGAGGAACTAACTGAGATGGAGGAACTAACTGAGGAACCAATCTCTCTGGGAGATGAAGGGAATGATTGGACTGCCATGGAAAACTATTTTTTTGATGAGCTCATTAGTTAAGAAAAAAATATATACTAAAATGCGG其中4:由APUZiS因核苷酸序列推測(cè)得到的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID N0.4)MDLKASALRKGAffSKEEDDLLRNCIDKYGEGKWSSVPERAGLKRCRKSCRLRWLNYLSPKINRGKFSDDEIDLLIRLHKLLGNRWSLIAGRIPGRTANDIKNYWNSHLSKRVEATKCRSKTIDAQVARPNPERDSANWSWPTNIGTNYGNNLEAEETEMPKLRTSQENQGERSNDLIMENGWEELMLHTSDVSLQNFQIDFKTPEMEELTEMEELTEEPISLGDEGNDffTAMENYFFDELIS.【附圖說明】]
圖1 FhPAPlLl取(呆守結(jié)構(gòu)域分析；
圖2 FhPAPlLl和FhPAPIL2系統(tǒng)進(jìn)化分析；
圖3 FhPAPlLm難]轉(zhuǎn)錄激活活性分析；
圖4轉(zhuǎn)基因擬南芥表型變化；
圖5轉(zhuǎn)基因煙草表型變化；
圖6專基因擬南芥表型變化；
圖7?；驘煵荼硇妥兓?。
[0012]
【具體實(shí)施方式】
[0013]在下面的具體實(shí)施例子中進(jìn)一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
[0014]實(shí)施例1基因全長(zhǎng)的克隆
[實(shí)施例1-1]目的片段的獲得:根據(jù)擬南芥PAPl序列，進(jìn)行本地Blast。篩選與擬南芥PAPl同源性較高的序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得長(zhǎng)度為212bp的片段，并包含起始密碼子ATG。
[0015][實(shí)施例基因3’序列的獲得:根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列，設(shè)計(jì)特異性上游引物，即5’ -GGCAGGACTAAGAAGGTGTCG-3’ ；根據(jù)mRNA保守的polyA結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特異的下游引物:5’ -AAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC-3’。用 Trizol 試劑盒提取紅花香雪蘭花朵盛開時(shí)期的總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA的第一條鏈，以此作為模板進(jìn)行RACE，得到的717bp的PCR產(chǎn)物。
[0016][實(shí)施例基因全長(zhǎng)序列的獲得:根據(jù)上述測(cè)序得到的結(jié)果，設(shè)計(jì)特異的上游引物，即 5’ -CCTCCCCCTAATGTCTTATCTTG-3’ 和 5’ -ATATATAGATATCAGTATTGTTA-3’的下游引物。用Trizol試劑盒提取紅花香雪蘭花瓣的總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA的第一條鏈，以此作為模板進(jìn)行RT-PCR，得到/?/?/5^基因全長(zhǎng)序列。
[0017]實(shí)施例2連因全長(zhǎng)的克隆
[實(shí)施例2-1]目的片段的獲得:根據(jù)擬南芥PAPl序列，進(jìn)行本地Blast。篩選與擬南芥PAPl同源性較高的序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得755bp的片段，序列分析顯示該片段包含ATG起始密碼子和TAA終止密碼子。
[0018][實(shí)施例2-2]因全長(zhǎng)序列的獲得:根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列，設(shè)計(jì)特異性上游引物，即 5’ -AATGGATCTCAAAGCTTCAG-3，和 5’ -CCGCAITTTAGTATATAITITITT-3’ 的下游引物。用Trizol試劑盒提取紅花香雪蘭花朵盛開時(shí)期的總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA的第一條鏈，以此作為模板進(jìn)行RT-PCR，得到的難]基因全長(zhǎng)序列。
[0019]
實(shí)施例3 FhPAPlLm難]轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)
為了驗(yàn)證和難]轉(zhuǎn)錄活性，利用Gal4-GUS為報(bào)告基因進(jìn)行擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，以⑶-VP為陽性對(duì)照。分別將FhPAPlLl取/?/?/5^難]開放閱讀框與⑶(Gal4 DNA結(jié)合區(qū))融合，35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，克隆到/?況7竭^體上，構(gòu)建成