表達鼠傷寒沙門菌OmpL蛋白的重組豬痘病毒載體疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，涉及一種表達鼠傷寒沙門菌OmpL蛋白的重組豬痘病 毒載體疫苗，具體涉及一種鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L的編碼基因、包括該基因的轉(zhuǎn)移載體pUSGll/P28-〇mpL、重組豬痘病毒rSPV-OmpL及其應(yīng)用、制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium)是一種重要的人畜共患病原菌，其 感染發(fā)病率居沙門菌感染的首位。鼠傷寒沙門菌在自然界分布廣泛，主要經(jīng)水和食物傳 播，可引起人類和動物的多種疾病。鼠傷寒沙門菌感染仔豬，可導(dǎo)致仔豬副傷寒（swine paratyphoid)。主要引起豬的敗血癥、腸炎、肺炎和肝炎，也可使懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)。隨著 養(yǎng)豬業(yè)的集約化發(fā)展，該病對豬場正常生產(chǎn)的不利影響越來越大。
[0003] 外膜蛋白L(outer membrane porin L，0mpL)是鼠傷寒沙門菌外膜中的主要結(jié)構(gòu)， 對該菌的免疫和致病作用都有重要影響。OmpL蛋白具有良好的免疫原性，能增強實驗動物 的細胞免疫和體液免疫，抵抗同源菌或異源菌的攻擊，不同血清型菌株之間具有相同的外 膜蛋白免疫抗原，可產(chǎn)生交叉免疫保護作用。
[0004] 重組豬痘病毒（Swinepoxvirus，SPV)作為表達載體，有許多特有的優(yōu)點：（l)SPV 的復(fù)制發(fā)生在細胞質(zhì)內(nèi)，避免了病毒基因組整合到宿主細胞染色體中的可能，從而消除了 對人類和其他動物的潛在威脅。（2)SPV基因組容量大，至少能容納25kb外源基因的插入， 適合研制多價疫苗，并且具有多個復(fù)制非必需基因可用作外源基因的插入位點。（3)SPV只 感染豬，具有嚴格的宿主特異性，生物安全性高。（4)重組SPV載體疫苗有多種接種途徑，包 括口服免疫，可大大降低勞動強度，同時可避免因疫苗接種導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)。目前，并沒有 報道利用SPV載體構(gòu)建表達鼠傷寒沙門菌的外膜蛋白L的重組豬痘病毒，更沒有利用SPV 載體表達鼠傷寒沙門菌的外膜蛋白L預(yù)防鼠傷寒沙門菌的疫苗或藥物的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是研制一種能夠有效防制鼠傷寒沙門菌的重組豬痘病毒載體疫苗， 對豬感染鼠傷寒沙門菌的預(yù)防工作提供有力的支持。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
[0007] 1.本發(fā)明提供一種鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L的編碼基因，該編碼基因序列如SEQ iD NO. 1所示，表達的外膜蛋白L影響鼠傷寒沙門菌的免疫和致病。
[0008] 2.本發(fā)明還提供一種鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L基因的轉(zhuǎn)移載體pUSGl1/ P28-〇mpL，該專利載體具有鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L基因，其序列如SEQIDNO. 1所示，通 過將鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L基因序列插入到BamHI和Sail酶切位點之間。
[0009] 3.本發(fā)明還提供一種重組豬痘病毒rSPV-OmpL，所述豬痘病毒是在豬痘病毒 VR-363中插入鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L基因獲得的，其中，所述鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L基 因序列如SEQIDNO. 1所示，能夠表達目的蛋白OmpL。
[0010] 本發(fā)明通過Westernblot、間接免疫熒光檢測證明重組豬痘病毒rSPV-OmpL能夠 在細胞內(nèi)高效率的表達蛋白OmpL。通過動物免疫試驗，重組豬痘病毒rSPV-OmpL能夠在免 疫動物體內(nèi)大量表達目的蛋白OmpL，能夠誘導(dǎo)動物體內(nèi)產(chǎn)生較高效價的針對OmpL的抗體， 并對免疫動物產(chǎn)生良好的保護作用。
[0011] 4.本發(fā)明還提供一種疫苗組合物，該組合物包括重組豬痘病毒rSPV-OmpL，該重 組豬痘病毒包括豬痘病毒載體VR-363和鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L基因。
[0012] 5.本發(fā)明還提供上述1提供的編碼基因在預(yù)防豬感染鼠傷寒沙門菌上的應(yīng)用。
[0013] 6.本發(fā)明還提供上述2或3所述的轉(zhuǎn)移載體pUSGll/P28-〇mpL在預(yù)防豬感染鼠傷 寒沙門菌上的應(yīng)用。
[0014] 7.上述4提供的疫苗組合物在預(yù)防豬感染鼠傷寒沙門菌上的應(yīng)用，其中，疫苗中 所述重組豬痘病毒rSPV-OmpL的濃度維持在1.OX10sPFU/mL。
[0015] 本發(fā)明所述疫苗的接種途經(jīng)包括但不限于肌肉注射等。
[0016] 8.本發(fā)明還提供上述重組豬痘病毒rSPV-OmpL的制備方法，該方法包括如下步 驟：
[0017] (1)引物設(shè)計：根據(jù)鼠傷寒沙門菌的基因序列設(shè)計一對針對ompL基因的特異性引 物，在引物的5'端分別含有限制性內(nèi)切酶Sail和BamHI的酶切位點；
[0018] ⑵目的基因片段與載體連接：以鼠傷寒沙門菌基因組為模板，通過步驟⑴設(shè)計 的特異性引物進行PCR擴增獲得擴增片段；利用限制性內(nèi)切酶BamHI和Sail對擴增片段進 行酶切，獲得目的片段，其序列如SEQIDNO. 1所示；利用限制性內(nèi)切酶BamHI和Sail酶切 PUSG11/P28獲得酶切載體，試劑盒回收；連接酶反應(yīng)體系中，連接目的片段和酶切載體，獲 得穿梭載體pUSGll/P28-〇mpL;
[0019] (3)重組豬痘病毒rSPV-OmpL的構(gòu)建：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法使穿梭載體pUSGl1/ P28-〇mpL與豬痘病毒發(fā)生同源重組，收獲重組豬痘病毒rSPV-OmpL原液；
[0020] (4)通過噬斑純化重組豬痘病毒。
[0021] 9.上述8提供的制備方法，其中，步驟⑴所述的特異性引物為，P1序列如SEQID NO. 2所示，P2序列如SEQIDNO. 3所示。
[0022] 10.上述8提供的制備方法，其中，步驟⑶所述的重組豬痘病毒rSPV-OmpL原液 的構(gòu)建方法為：提前一天將PK15細胞接種到24孔細胞培養(yǎng)板上，使其長成單層細胞；先用 0. 05M0I的SPV感染PK15單層細胞，lh后將脂質(zhì)體與穿梭載體的混合液加入到24孔細胞 培養(yǎng)板中；PK15細胞繼續(xù)在37°C5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，待能看到明顯的病毒 噬斑后，將其反復(fù)凍融3次，收獲重組豬痘病毒rSPV-OmpL原液。
[0023] 本發(fā)明的有益效果：
[0024] 1.本發(fā)明首次將鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L的編碼基因插入到載體pUSGll/P28獲 得轉(zhuǎn)移載體pUSGll/P28-〇mpL，以該轉(zhuǎn)移載體與豬痘病毒VR-363發(fā)生同源重組，獲得重組 豬痘病毒。該重組豬痘病毒能夠穩(wěn)定、高效率表達鼠傷寒沙門菌外膜蛋白L，培養(yǎng)滴度穩(wěn)定 在l(f2PFU/mL。
[0025] 2.通過免疫試驗證明，重組豬痘病毒rSPV-OmpL免疫組的小鼠血清抗體效價顯著 高于對比組，證明本發(fā)明所述重組豬痘病毒rSPV-OmpL能有效的刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。 經(jīng)過攻毒保護試驗，以重組豬痘病毒rSPV-OmpL制成的疫苗對小鼠的免疫保護率可高達 80%〇
[0026] 3.重組豬痘病毒不感染其他動物，只感染豬，在豬體產(chǎn)生溫和反應(yīng)，使用比較安 全。突破了鼠傷寒沙門菌常規(guī)滅活疫苗和弱毒疫苗的局限性，兼具有弱毒疫苗的免疫效果 好和滅活疫苗的安全性高等特點，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0027] 圖1轉(zhuǎn)移載體pUSGll/P28-〇mpL結(jié)構(gòu)示意圖；其中，LF和RF分別為豬痘病毒左、 右同源交換序列；P11和P28為豬痘病毒啟動子；GFP為報告基因；OmpL為目的蛋白基因
[0028] 圖2轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUSGll/P28-〇mpL雙酶切產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果；其中，1、2:轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pUSGll/P28-〇mpL雙酶切產(chǎn)物；M:DL5000DNAMarker
[0029] 圖3重組豬痘病毒rSPV-OmpL的PCR檢測；其中，M :DL5000DNAMarker;1:重組 豬痘病毒rSPV-OmpL;2:豬痘病毒野毒SPV
[0030] 圖4重組豬痘病毒rSPV-OmpL的Western blot檢測；其中，1 :感染豬痘病毒野毒 SPV的PK15細胞；2 :感染重組豬痘病毒rSPV-OmpL的PK15細胞；M :預(yù)染蛋白Marker
[0031] 圖5重組豬痘病毒rSPV-OmpL的間接免疫熒光檢測；其中，A:重組豬痘病毒 rSPV-OmpL感染的PK15細胞，能