一種三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-redv共聚物及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及了一種三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物及制備方法， 屬于醫(yī)藥基因治療領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，siRNA和miRNA作為基因表達(dá)的重要調(diào)控者，具有特異性高、作用 迅速和高效等優(yōu)點(diǎn)，在治療癌癥、骨和血管疾病中發(fā)揮重要積極作用，受到廣大研 究人員的關(guān)注(MuthiahM,ParkI,ChoC.Nanoparticle-mediateddeliveryof therapeuticgenes:focusonmiRNAtherapeutics.ExpertOpin.DrugDeliv 2013, 10(9)，1259-1273)。
[0003] SiRNA和miRNA本身易于受到核酸酶的降解，因此研究具有較高轉(zhuǎn)染效率的載體， 攜帶基因到達(dá)病灶部位并發(fā)揮基因的作用，成為一個(gè)重要的研究課題。三甲基化殼聚糖 (TMC)是殼聚糖的一種衍生物具有良好的生物相容性、可降解性、良好的水溶性以及復(fù)合基 因的能力，并廣泛的應(yīng)用于藥物載體和醫(yī)用輔助材料。聚乙二醇（PEG)具有良好的親水性， 在TMC上引入PEG鏈段，有利于提高TMC在水中的溶解性和載體的穩(wěn)定性，降低TMC的細(xì)胞 毒性。
[0004] 使用含有雙端基官能團(tuán)的聚乙二醇，可將三甲基化殼聚糖與具有腦靶向功能的多 肽RVG(序列為YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)連接，形成三甲基殼聚糖-接枝-聚乙 二醇-RVG，并應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域，有助于實(shí)現(xiàn)核酸類藥物通過血腦屏障和腦主動(dòng)靶向定 位，并提高了核酸的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率（姜同英，王思玲，高亦鯤.一種三甲基殼聚糖-接 枝-聚乙二醇/核酸腦靶向膠束及其制備方法.CN103182087B，2015)。其中，借助了功能肽 RVG上的巰基與PEG-端的馬來酰亞胺基團(tuán)、乙烯砜基團(tuán)或硫醇基團(tuán)反應(yīng)。
[0005] 精氨酸_谷氨酸-天冬氨酸-繳氨酸（Arg-Glu-Asp-Val,REDV)存在于纖維連接 蛋白的III-CS區(qū)域。有研究表明，含有REDV序列合成肽的基板能夠特異性地粘附血管內(nèi) 皮細(xì)胞，而不粘附平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞（HubbellJA，MassiaSP，DesaiNP，Drumheller PD.Endothelialcell-selectivematerialsfortissueengineeringinthevascular graftviaanewreceptor.NatureBiotechnology, 1991，9 (6):568-572)〇
[0006] 本發(fā)明進(jìn)一步擴(kuò)展了三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇_小肽的合成方法和應(yīng) 用范圍。使用含有雙端基官能團(tuán)的鄰二硫吡啶-聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯，通過其中 的二硫鍵將具有特異性粘附血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能小肽REDV與PEG連接而形成三甲基化殼 聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物，可以縮短合成時(shí)間。該三甲基化殼聚糖-接枝-聚 乙二醇-REDV共聚物制備方法的優(yōu)點(diǎn)是室溫反應(yīng)，反應(yīng)過程簡單。制備的帶有正電荷的共 聚物與帶有負(fù)電荷核酸等通過靜電作用復(fù)合得到納米粒子。該納米粒子在水溶液中分散性 好，粒徑較均一，電位為正值，具有穩(wěn)定性好、靶向內(nèi)皮細(xì)胞和轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)點(diǎn)，用于醫(yī)藥 基因治療領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于制備一種三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] 上述三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物的結(jié)構(gòu)式為：
[0010]
[0011] 上述的三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物，其特征在于所述殼聚 糖的重均分子量為50KDa，殼聚糖脫乙酰度大于95%;三甲基化殼聚糖的甲基化度為30~ 50%〇
[0012] 上述三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物，其特征在于所述聚乙二醇 的分子量為3~5KDa，聚乙二醇的雙端的活性基團(tuán)分別為琥珀酰亞胺基團(tuán)和吡啶基二硫基 團(tuán)；聚乙二醇的接枝率為5~50%，。
[0013] 上述三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物，其特征在于所述REDV小肽 為精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-半胱氨酸（REDV-Cys)及其他可以靶向內(nèi)皮細(xì)胞 的多肽。
[0014] 上述三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物的制備方法，包括以下步驟：
[0015] (1)制備三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-鄰二硫吡啶共聚物；
[0016] (2)制備三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物。
[0017] 所述的步驟（1)制備三甲基化殼聚糖_接枝-聚乙二醇-鄰二硫吡啶共聚物：原 料鄰二硫吡啶-聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯和TMC的質(zhì)量比為1~5:1，TMC的濃度為 10mg/mL，去離子水作為溶劑，室溫下反應(yīng)3~10h。產(chǎn)物使用去離子水透析，最后凍干得 到三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-鄰二硫吡啶共聚物。
[0018] 所述的步驟（2)制備三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物：三甲基化 殼聚糖-接枝-聚乙二醇-鄰二硫吡啶共聚物和REDV小肽的質(zhì)量比為10~20: 1，REDV小 肽的濃度為0.25~0.5mg/mL,去離子水為溶劑，室溫反應(yīng)2~6h。未參加反應(yīng)的小肽通 過離心超濾并透析除去，制得三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物。
[0019] 上述三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物可與帶負(fù)電荷的核酸自組裝 為納米粒子，其特征在于包括步驟：將制備的三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV溶 解于焦碳酸二乙酯（DEPC)處理過的水中與核酸溶液進(jìn)行混合，室溫靜置30min。
[0020] 上述納米粒子，其特征在于制備的納米粒子的動(dòng)態(tài)光散射測試的粒徑在50~ 500nm之間，G電位在2~30mV之間，靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞，用于醫(yī)藥基因治療領(lǐng)域。
[0021] 本發(fā)明公布了一種三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物的制備方 法。首先三甲基化殼聚糖與鄰二硫吡啶-聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯進(jìn)行反應(yīng)，得 到三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-鄰二硫吡啶共聚物。然后加入特異性小肽精氨 酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-半胱氨酸（REDV-Cys)，通過共聚物中鄰二硫吡啶 基團(tuán)和小肽中巰基進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，制得三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚 物。該制備方法的優(yōu)點(diǎn)是室溫反應(yīng)，反應(yīng)過程簡單。本發(fā)明的共聚物帶有正電荷可與帶有 負(fù)電荷核酸通過靜電作用復(fù)合得到納米粒子。與基因復(fù)合后的納米粒子在水溶液中分散性 好，粒徑較均一，電位為正值，具有穩(wěn)定、靶向內(nèi)皮細(xì)胞和轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)點(diǎn)，用于醫(yī)藥 基因治療領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0022] 圖1 :實(shí)施例1制備的三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物與miRNA復(fù) 合的納米粒子的透射電子顯微鏡照片。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面通過實(shí)施案例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述，以下實(shí)施案例是對本發(fā) 明的進(jìn)一步說明，并不限制本發(fā)明的適用范圍。
[0024] 實(shí)施例1 :
[0025] 在裝有磁力攪拌的三口瓶中，將lg殼聚糖（M.=5、丨04 )和2. 4g碘化鈉加入到 5. 6mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的NaOH和40mLN-甲基-2-吡咯烷酮的混合溶液中，并加入6mL 碘甲烷，在60°C下回流反應(yīng)45min。再加入5. 6mL的15%NaOH溶液和3mL的碘甲烷，攪 拌反應(yīng)45min。之后加入40mL乙醇來終止反應(yīng)，將產(chǎn)物過濾并使用乙醚洗滌。最后，將產(chǎn) 物溶解在40mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%NaCl溶液中，攪拌3h。產(chǎn)物使用去離子水透析72h，凍干 得到三甲基化殼聚糖。
[0026] 在20mg三甲基化殼聚糖和60mg鄰二硫吡啶-聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯中， 加入2mL去離子水作為溶劑，在室溫下反應(yīng)6h。反應(yīng)產(chǎn)物使用去離子水透析，最后凍干得 到三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-鄰二硫吡啶共聚物。
[0027] 在10mg三甲基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇-鄰二硫吡啶共聚物和0. 8mgREDV-Cys 小肽中，加入2mL的去離子水并反應(yīng)2h。