一種青花菜發(fā)育膨大小孢子分離的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種青花菜發(fā)育膨大小孢子分離的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]青花菜(B rassica oleracea L.var.1 talica)又名西蘭花、綠菜花、莖椰菜等，以主莖及側(cè)枝頂端形成的綠色花球為產(chǎn)品，營養(yǎng)豐富，色、香、味具佳，是國際市場十分暢銷的一種名特蔬菜。目前我國青花菜主栽品種大都來自國外，具有自主知識產(chǎn)權(quán)的品種匱乏，主要因為育種資源少，難以配制好的品種。傳統(tǒng)上，多代自交分離一般需要5~6年的時間才能獲得純合穩(wěn)定的親本材料。費力耗時。而游離小孢子培養(yǎng)方法可在1~2年內(nèi)快速獲得雙單倍體純系，比傳統(tǒng)的方法縮短了 3~4年的時間。因此在優(yōu)良自交系的創(chuàng)制和提高新品種選育效率等方面具有重要作用。同時，隱性性狀也易于表達，豐富了育種資源。
[0003]自1982年Lichter首次報道獲得甘藍型油菜小孢子再生植株以來，十字花科植物，尤其是油菜的小孢子培養(yǎng)，無論是在出胚率、出胚量，還是胚培養(yǎng)及再生植株方面都獲得了很大的成功。青花菜游離小孢子培養(yǎng)，國外研究最早見于Takahata等(1991)報道，國內(nèi)則是張德雙等于1997年在巴綠青花菜等品種的研究上獲得成功。隨后，張延國等(2005)、方淑桂等(2005)、袁素霞等(2009)、張振超等(2013，2014)也做了大量研究，培養(yǎng)效率得到一定程度提高。
[0004]有關(guān)小孢子胚胎發(fā)育過程中的分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等機理研究較少，究其原因是小孢子體積微小，要獲得足夠數(shù)量的試驗材料需要做大量、重復(fù)的小孢子培養(yǎng)試驗，而把發(fā)育膨大的小孢子與未發(fā)育的小孢子分離開存在困難。根據(jù)小孢子直徑大小而采用不同孔徑的微孔濾網(wǎng)過濾的方法可以簡便有效的把發(fā)育膨大的小孢子分離出來，從而為青花菜小孢子胚胎發(fā)育機理研究提供足夠的試驗材料，具有重要的實踐意義。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種青花菜發(fā)育膨大小孢子分離的方法，根據(jù)發(fā)育膨大小孢子與未發(fā)育小孢子直徑差異，采用不同孔徑微孔濾網(wǎng)過濾的方法可以簡便有效的把發(fā)育膨大的小孢子分離出來，從而為小孢子胚胎發(fā)育機理研究提供試驗分析材料。
[0007]—種青花菜發(fā)育膨大小孢子分離的方法，包括以下步驟:
步驟I，取青花菜花蕾在無菌環(huán)境下滅菌處理，得無菌花蕾；
步驟2，向無菌花蕾中加入NLN-13液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，研磨成懸浮液后過濾，將濾液離心，并向離心后的沉淀中加入NLN-13液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，得小孢子懸浮液；
步驟3，將小孢子懸浮液分裝到無菌培養(yǎng)皿中，置于黑暗中32°C?33°C下熱激處理I?3天后，備用； 步驟4，將熱激處理后的無菌培養(yǎng)皿繼續(xù)置于黑暗中，23?27°C培養(yǎng)I?10天，再用顯微鏡觀察小孢子發(fā)育情況，并利用微孔濾網(wǎng)進行梯度過濾，得發(fā)育膨大的小孢子；
步驟5，將發(fā)育膨大的小孢子用蒸餾水洗脫到離心管中離心，傾去上清液，連同離心管置于液氮中保存?zhèn)溆谩?br>[0008]作為優(yōu)選的是，步驟I中所述青花菜花蕾處于單核晚期至雙核早期，花瓣和花藥長度比為0.85?1.15。
[0009]作為優(yōu)選的是，步驟I中所述滅菌處理是將青菜花花蕾在無菌操作臺上先用滅菌液滅菌，再用無菌水震蕩清洗3?5次，所述滅菌液滅菌為質(zhì)量百分濃度為5.6%次氯酸鈉配制而成滅菌18?20分鐘，或用質(zhì)量百分濃度為0.1%氯化汞配制而成，滅菌10?15分鐘。
[0010]作為優(yōu)選的是，步驟2中所述NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基由NLN液體培養(yǎng)基IL和蔗糖130g 組成，pH 6.0 ?6.2 ;
所述的NLN液體培養(yǎng)基，以IL計，組成為=KNO3 125mg，Ca(NO3)2.4H20 500mg，MgSO4.7H20 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4.H2O 18.95mg，ZnSO4.7H20 8.6mg，Na2MoO4.2H20 0.25mg，CuSO4.5H20 0.025mg，CoCl2.6H20 0.025mg，維生素 BI 0.5mg，維生素 B6 0.5mg，生物素 0.05mg，葉酸 0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，F(xiàn)eSO4.7Η20 27.8mg，肌醇 lOOmg，甘氨酸2mg，煙酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，維生素B5 5mg，絲氨酸lOOmg，余量為無菌水。
[0011]作為優(yōu)選的是，步驟4中所述的梯度過濾為將黑暗中23?27°C培養(yǎng)I?10天的小孢子懸浮液，先用300?350目濾網(wǎng)過濾，以除去體積較大的物質(zhì)，濾液用NLN-13液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮后用450?600目濾網(wǎng)過濾，重復(fù)2?3次得發(fā)育膨大的小孢子。
[0012]作為優(yōu)選的是，步驟4中所述發(fā)育膨大的小孢子是指熱激處理后在20倍顯微鏡下隨機觀察10個視野，發(fā)育膨大小孢子數(shù)量占全部小孢子的比例超過5%。
[0013]作為優(yōu)選的是，步驟4中梯度過濾為真空抽濾，所用真空度為20_50kpa。
[0014]
有益效果
1、本發(fā)明針對青花菜發(fā)育膨大小孢子分離困難的問題，提供了一種根據(jù)發(fā)育和未發(fā)育小孢子直徑大小差異，采用不同孔徑微孔濾網(wǎng)過濾分離的方法，把發(fā)育膨大小孢子與未發(fā)育小孢子分離開，從而獲得足夠數(shù)量的試驗材料。通過本方法獲得的小孢子試驗材料中，發(fā)育膨大的小孢子數(shù)量占比提高到80%以上，而未通過不同孔徑濾膜梯度過濾對照最高僅為15%。
[0015]2、通過大量重復(fù)進行小孢子培養(yǎng)操作、微孔濾網(wǎng)過濾分離，獲得了足夠數(shù)量的試驗材料，為分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了保障。
[0016]
【具體實施方式】
[0017] 實施例1
步驟1，取青花菜生長健康、無病蟲害的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體植株，取花序上花瓣和花藥長度比為0.85、單核晚期至雙核早期的花蕾，在超凈工作臺上把青花菜花蕾放入無菌培養(yǎng)皿中，加入滅菌液，放到搖床上搖動進行表面消毒20分鐘，再用無菌水蕩洗3次后，備用，其中，滅菌液由次氯酸鈉水溶液56ml/L、無水乙醇100ml/L、洗潔精10滴/L、無菌水配制成；
步驟2，在超凈工作臺上將12個無菌花蕾置于無菌燒杯中，加入1ml NLN-13液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，該懸浮液用300目無菌濾網(wǎng)過濾到50ml離心管中，蓋緊，900rpm/min離心3min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入1ml NLN-13液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按上述方法再離心2次，棄上清液；加入NLN-13液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基40ml，得到小孢子懸浮液，其中，NLN-13液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基:NLN液體培養(yǎng)基IL+蔗糖130g/L，pH6.0，過濾滅菌；
其組成為:KN03 125mg，Ca (NO3) 2.4H20 500mg，MgSO4.7H20 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO36.2mg，MnSO4.H2O 18.95mg，ZnSO4.7H20 8.6mg，Na2MoO4.2H20 0.25mg，CuSO4.5H200.025mg，CoCl2.6H20 0.025mg，維生素 BI 0.5mg，維生素 B6 0.5mg，生物素 0.05mg，葉酸0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，F(xiàn)eSO4.7H20 27.8mg，肌醇 lOOmg，甘氨酸 2mg，煙酸 5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，維生素B5 5mg，絲氨酸10mg和余量無菌水；
步驟3，將小孢子懸浮液分裝到60mm無菌培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿加4ml小孢子懸浮液，加蓋后用parafilm膜封口，后置于32.5°C恒溫生化培養(yǎng)箱里、黑暗條件下熱激處理I天；步驟4，將熱激處理后的無菌培養(yǎng)皿繼續(xù)置于黑暗中25°C下培養(yǎng)3天，當(dāng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)小孢子胚胎發(fā)育率超過5%時，把小孢子懸浮液先用300目濾網(wǎng)過濾，以除去體積較大的物質(zhì)，濾液用NLN-13液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮后用450目濾網(wǎng)過濾，獲得的沉淀用NLN-13液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮后過濾，重復(fù)2次，最終獲得的沉淀即為發(fā)育的小孢子；
步驟5，將發(fā)育膨大的小孢子用蒸餾水洗脫到離心管中離心，傾去上清液，把離心管置于液氮中保存?zhèn)溆谩?br>[0018]結(jié)果:通過本方法獲得的小孢子試驗