重新接種中空纖維生物反應(yīng)器系統(tǒng)中生長的貼壁細胞的方法
【專利說明】重新接種中空纖維生物反應(yīng)器系統(tǒng)中生長的貼壁細胞的方 法 陽OOU 本申請是2012年10月26日遞交的申請?zhí)枮?01180021315. 9,發(fā)明名稱為"重新 接種中空纖維生物反應(yīng)器系統(tǒng)中生長的貼壁細胞的方法"的分案申請。 柳0引優(yōu)先權(quán)
[0003] 本專利申請要求于2010年5月5日提交的臨時專利申請61/331，660的優(yōu)先權(quán)， 且本專利申請是于2008年3月5日提交的美國專利申請12/042, 763的部分接續(xù)申請。
【背景技術(shù)】
[0004] 在多種處理和治療中，干細胞的使用正受到越來越多的關(guān)注。干細胞可被用于修 復(fù)或替代受損或有缺陷的組織，且具有治療大范圍疾病的廣泛的臨床應(yīng)用。
[0005] 細胞擴增系統(tǒng)可用于使干細胞W及其它類型的細胞（貼壁細胞和非貼壁細胞）生 長。在細胞將要生長和分裂前，貼壁細胞需要貼附的表面。而非貼壁細胞在懸浮液中漂浮 的同時進行生長和分裂。
[0006] 細胞擴增系統(tǒng)為生長的細胞提供營養(yǎng)物且移除代謝物，W及供應(yīng)有助于細胞生長 的生理化學(xué)環(huán)境。細胞擴增系統(tǒng)在本領(lǐng)域是已知的。
[0007] 生物反應(yīng)器或細胞生長腔體作為細胞擴增系統(tǒng)的組件在為擴增的細胞提供最優(yōu) 化環(huán)境中起到重要作用。在本領(lǐng)域中已知很多類型的生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器裝置包括 培養(yǎng)瓶、轉(zhuǎn)瓶（rollerbottle)、振蕩瓶（shakerflask)、攬拌槽式反應(yīng)器（Stirred-tank reactor)、氣升式反應(yīng)器（air-liftreactor)和中空纖維生物反應(yīng)器。
[0008] 一旦生物反應(yīng)器中擴增的細胞達到細胞覆蓋或期望的細胞數(shù)量，則需要收集細 胞，且如果期望進一步的細胞生長，則需要將細胞重新接種在相同或不同的生物反應(yīng)器中。
[0009] 不管使用何種類型的生物反應(yīng)器裝置，為了收集貼壁細胞，必須首先從細胞生長 的表面上移除細胞。為了從生長表面移除貼壁細胞，初始清洗細胞W移除抑制膜蛋白酶的 離子（儀、巧）。然后將膜蛋白酶添加至經(jīng)清洗的細胞W使細胞從表面松落。一旦細胞被松 落，則從膜表面移除它們，且通過清洗被移除的細胞或使它們旋轉(zhuǎn)沉淀為細胞團、移除周圍 的流體且將它們懸浮在新的生長培養(yǎng)基中進行處理W移除膜蛋白酶。
[0010] 該程序容易在細胞生長在平板上的開放系統(tǒng)（諸如培養(yǎng)瓶）中進行，其中該程序 在層流凈化罩中進行。但是在使用中空纖維生物反應(yīng)器的封閉系統(tǒng)中，該系統(tǒng)對大氣是封 閉的。沒有簡單的方法來添加流體或從系統(tǒng)中移除流體，且包含在細胞生長所需的生長培 養(yǎng)基中的離子由于通過中空纖維的超濾而從細胞生長空間中丟失。因此細胞存活在被稀釋 的培養(yǎng)基（來自從細胞初始清洗進入系統(tǒng)的添加的流體）、膜蛋白酶（來自用于使細胞從膜 松落的膜蛋白酶）、且由于超濾培養(yǎng)基中沒有離子（例如巧和儀）圍繞的環(huán)境中。
[0011] 運些因素可造成被直接重新接種在中空纖維生物反應(yīng)器中的收集的貼壁細胞的 細胞生長不足。
[0012] 因此，需要開發(fā)新的重新接種的方案W在使用中空纖維生物反應(yīng)器的細胞擴增系 統(tǒng)中使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明設(shè)及用于直接重新接種收集的在中空纖維生物反應(yīng)器中生長的貼壁細胞 的方法，所述中空纖維生物反應(yīng)器具有內(nèi)毛細管空間（intracapillaryspace)和外毛細管 空間（extracapillaryspace)，其中細胞生長空間是內(nèi)毛細管空間或外毛細管空間中的一 種。該方法包括W下步驟：從所述細胞生長空間移除生長培養(yǎng)基；清洗所述細胞W從所述 細胞生長空間移除殘留的生長培養(yǎng)基；通過將膜蛋白酶添加至所述細胞生長空間，使所述 細胞從中空纖維生物反應(yīng)器的中空纖維上松落；從所述細胞生長空間移除細胞和所有膜蛋 白酶；使來自被移除的細胞中的膜蛋白酶失活；W及，將被移除的細胞和膜蛋白酶直接重 新接種在中空纖維生物反應(yīng)器的細胞生長空間中。
[0014] 本發(fā)明還要求了一種制造收集培養(yǎng)基的方法，所述方法通過使用ChVh+0v@^= CfVh+CcVc計算培養(yǎng)基中需要的離子和蛋白質(zhì)的量，且將計算出的量的離子和蛋白質(zhì)加入培 養(yǎng)基中，W在將貼壁細胞直接重新接種在中空纖維生物反應(yīng)器中使用。
【附圖說明】
[0015] 圖1為在本發(fā)明中有用的中空纖維生物反應(yīng)器的示例圖。
[0016] 圖2示出了可被本發(fā)明使用的細胞擴增系統(tǒng)的示例圖。
[0017] 圖3是在根據(jù)本發(fā)明完整重新接種的程序之前、過程中及之后的代謝濃度的示 圖。
【具體實施方式】
[0018] 本申請大體設(shè)及用于收集和/或重新接種來自封閉細胞擴增系統(tǒng)的中空纖維細 胞生長腔體/生物反應(yīng)器的貼壁細胞（尤其為間充質(zhì)干細胞）的無菌方法。封閉系統(tǒng)指該 系統(tǒng)沒有直接暴露于大氣。
[0019] 從細胞擴增系統(tǒng)收集擴增的細胞包括從生物反應(yīng)器中移除所有擴增的細胞。重新 接種收集到的細胞包括：將所有被移除的細胞重新裝載在相同或不同的生物反應(yīng)器中W用 于進一步擴增；或，將收集到的細胞的一部分重新裝載在相同或不同的生物反應(yīng)器中，同時 保留被移除細胞的剩余部分用于隨后的應(yīng)用。
[0020] 現(xiàn)在參考圖1，在正面立視圖中示出了可被本發(fā)明使用的中空纖維細胞生長腔體 100的實例。細胞生長腔體100具有縱向軸LA-LA，且包括細胞生長腔體的殼體104。在至 少一個實施方式中，細胞生長腔體的殼體104包括四個開孔（opening)或端口（port)JC 入口 108、IC出口 120、EC入口 128和EC出口 132。應(yīng)注意在附圖中，相同的元件由相同的 標記表示。箭頭示出了流體流過生物反應(yīng)器100 (圖1)和細胞擴增系統(tǒng)200 (圖2)的方向。
[0021] 多個中空纖維116被配置在細胞生長腔體的殼體104內(nèi)。用于制造中空纖維116 的材料可W是能夠被制成中空纖維的任何生物相容的聚合材料。術(shù)語"中空纖維"、"中空纖 維毛細管"和"毛細管"可互換使用。多個中空纖維被稱為膜。
[0022] 中空纖維116的末端可通過連接材料（本文中還被稱為"灌封料（potting)"或 "灌封材料"）被灌封至細胞生長腔體的殼體104的末端。灌封料可為用于粘合中空纖維116 的任何適當?shù)牟牧?，但條件是不阻塞培養(yǎng)基（和如果期望的細胞）進入中空纖維的流動。 示例性的灌封材料包括（但并不限于）聚氨醋或其它適當?shù)恼澈匣蛘掣浇M分。端蓋112和 124被分別配置在傳質(zhì)裝置（masstransferdevice)的每一端。
[0023] 第一循環(huán)路徑202 (見圖2)中的細胞生長培養(yǎng)基通過在細胞生長腔體100的第一 縱向末端112處的IC入口 108穿入細胞生長腔體100,進入且穿過中空纖維116的毛細管 內(nèi)側(cè)（在各實施方式中被稱為毛細管內(nèi)（"1C")側(cè)或"IC空間"），且通過位于細胞生長腔 體100的第二縱向末端124的IC出口 120穿出細胞生長腔體100。在IC入口 108和IC出 口 120之間的流體路徑限定了細胞生長腔體100的IC部分126。
[0024] 第二循環(huán)路徑204 (見圖2)中的流體通過EC入口 128流入細胞生長腔體100,與 中空纖維116的毛細管外側(cè)或外部（被稱為"EC偵r或"EC空間"）接觸，且經(jīng)由EC出口 132離開細胞生長腔體100。EC入口 128和EC出口 132之間的流體路徑包括細胞生長腔體 100的EC部分136。經(jīng)由EC入口 128進入細胞生長腔體的流體與中空纖維116的外部接 觸。
[00巧]小分子（例如離子、水、氧氣、乳酸鹽等）可通過中空纖維從IC空間擴散至EC空 間，或從EC空間擴散至IC空間。大分子量的分子（諸如生長因子）通常太大而不能穿過 中空纖維膜，因此留在中空纖維的IC空間中。可根據(jù)需要替換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基還可通過氣 體轉(zhuǎn)移組件/氧合器232進行循環(huán)W根據(jù)需要交換氣體。
[00%] 在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，細胞通常被容納在第一循環(huán)路徑202中 的中空纖維的IC空間內(nèi)，但還可被容納在第二循環(huán)路徑204中的EC空間內(nèi)。不管細胞生 長在IC空間還是生長在EC空間中，細胞均生長在細胞生長空間中。
[0027]用于制造