大氣細(xì)粒子基因組dna的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域中大氣細(xì)粒子基因組DNA的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前我國(guó)環(huán)境問(wèn)題較為突出，環(huán)境污染已經(jīng)威脅到人類健康，特別是大氣污染問(wèn) 題日趨嚴(yán)重，靈鎖連城事件頻發(fā)。霧靈中的大氣細(xì)粒子（PM)粒徑較?。?lt; 10ym)，可W被人 體吸入，沉積在呼吸道、肺泡等部位從而引發(fā)疾病。顆粒物的直徑越小，進(jìn)入呼吸道的部位 越深。10ym直徑的顆粒物通常沉積在上呼吸道，5ym直徑的可進(jìn)入呼吸道的深部，2ymW 下的可100%深入到細(xì)支氣管和肺泡。根據(jù)其空氣動(dòng)力學(xué)直徑（d)可W將大氣細(xì)粒子分為3 類：粗顆粒物（courseparticle,cKlOum,PMio)、細(xì)顆粒物（fineparticle,d<2. 5um,PM2.5)、 超細(xì)顆粒物（ultrafineparticle,UFPs,d<0.lum,PM。.1)。隨著大氣細(xì)粒子的物理和化學(xué)特 性研究的趨于成熟，大氣細(xì)粒子中的微生物成分受到重視，建立檢測(cè)大細(xì)粒子中的微生物 組成成分的方法與手段變得至關(guān)重要。
[0003] 目前多級(jí)大氣細(xì)粒子采集主要利用濾膜式大氣顆粒物采樣器按照需要將不同粒 徑的大氣細(xì)粒子采集到大氣采樣濾膜上；用于分析環(huán)境樣品中微生物組成的手段主要是基 于測(cè)序的方法。隨著DNA提取技術(shù)的日益商業(yè)化，利用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取顯得 更加方便快捷，在不破壞大氣細(xì)粒子顆粒物內(nèi)基因組DNA結(jié)構(gòu)的條件下，提出有效地將大 氣細(xì)粒子顆粒物從大氣采樣濾膜上分離下來(lái)的具體方法，成為解決利用大氣采樣濾膜采樣 法獲得大氣細(xì)粒子顆粒物并有效提取得到大氣細(xì)粒子顆粒物內(nèi)基因組DNA的關(guān)鍵問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何將顆粒物從采樣濾膜上分離下來(lái)，提高大氣細(xì) 粒子基因組DNA的提取質(zhì)量和提取量。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了提取大氣細(xì)粒子基因組DNA的方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的提取大氣細(xì)粒子基因組DNA的方法，包括下述1) -6):
[0007] 1)用采樣濾膜采集大氣細(xì)粒子，得到含有大氣細(xì)粒子的采樣濾膜；
[0008] 2)將所述含有大氣細(xì)粒子的采樣濾膜用PBS緩沖液清洗，得到PBS緩沖液清洗后 的采樣濾膜；
[0009] 3)將所述PBS緩沖液清洗后的采樣濾膜進(jìn)行超聲清洗，得到超聲清洗后的采樣濾 膜；
[0010] 4)將所述超聲清洗后的采樣濾膜用所述PBS緩沖液清洗，得到PBS緩沖液二次清 洗后的采樣濾膜；
[0011] 5)將所述PBS清洗后的濾膜浸于所述PBS緩沖液中進(jìn)行震蕩得到大氣細(xì)粒子； 陽(yáng)〇1引6)提取所述大氣細(xì)粒子基因組DNA，得到大氣細(xì)粒子基因組DNA。
[0013] 上述方法中，所述采樣濾膜為石英濾膜。所述石英濾膜可小于等于9X10cm2。所 述石英濾膜具體可為Munktell公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為420065。所述石英濾膜為無(wú)菌石英 濾膜。所述無(wú)菌石英濾膜可在500-600°C下般燒5-6小時(shí)得到。
[0014] 所述PBS緩沖液可為無(wú)菌溶液，所述PBS緩沖液的抑可為7. 2-7. 4,所述PBS緩沖 液可由Solarbio公司的10XPBS緩沖液（產(chǎn)品目錄為P1022-500)稀釋十倍得到。
[0015] 上述方法中，所述將所述含有大氣細(xì)粒子的采樣濾膜用PBS緩沖液清洗可包括： 將所述含有大氣細(xì)粒子的采樣濾膜浸于所述PBS緩沖液中，得到濾膜-PBS混合物；將所述 濾膜-PBS混合物進(jìn)行離屯、，得到PBS緩沖液清洗后的采樣濾膜。
[0016] 上述方法中，所述超聲清洗可包括：將所述含有所述大氣細(xì)粒子的采樣濾膜浸于 所述PBS緩沖液中進(jìn)行超聲清洗，得到濾膜-PBS超聲混合物；將濾膜-PBS超聲混合物進(jìn)行 離屯、，得到超聲清洗后的采樣濾膜。
[0017] 上述方法中，所述超聲清洗的條件可為10°C、功率40%;所述超聲的時(shí)間可為 10-20分鐘，如15分鐘。所述超聲清洗可在超聲清洗機(jī)中進(jìn)行，所述超聲清洗機(jī)具體可為昆 山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品，型號(hào)為KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器。
[0018] 上述方法中，所述將所述超聲清洗后的采樣濾膜用所述PBS緩沖液清洗可包括： 將所述超聲清洗后的采樣濾膜浸于所述PBS緩沖液中，得到濾膜-PBS混合物；將所述濾 膜-PBS混合物進(jìn)行離屯、，得到PBS緩沖液二次清洗后的采樣濾膜。
[0019] 上述方法中，所述5)可包括：將所述PBS緩沖液二次清洗后的采樣濾膜浸泡于所 述PBS緩沖液中進(jìn)行震蕩，使所述PBS緩沖液二次清洗后的采樣濾膜上所述大氣細(xì)粒子懸 浮在所述PBS緩沖液中，棄所述采樣濾膜，得到大氣細(xì)粒子懸浮液；用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾所述 大氣細(xì)粒子懸浮液使所述大氣細(xì)粒子吸附于所述過(guò)濾器內(nèi)的微孔濾膜上，得到吸附有所述 大氣細(xì)粒子的微孔濾膜。
[0020] 上述方法中，所述過(guò)濾器可為可換膜針頭式過(guò)濾器。
[0021] 上述方法中，所述過(guò)濾器內(nèi)的微孔濾膜孔徑（直徑）可小于等于0. 22ym。
[0022] 上述方法中，所述震蕩的條件可為手動(dòng)震蕩，使所述PBS緩沖液二次清洗后的采 樣濾膜上所述大氣細(xì)粒子懸浮在所述PBS緩沖液中即可。
[0023] 上述方法中，所述提取所述大氣細(xì)粒子基因組DNA可包括：將所述吸附有所述大 氣細(xì)粒子的濾膜剪碎，得到濾膜碎片；利用±壤微生物DNA的提取方法提取所述濾膜碎片 上的基因組DNA，得到大氣細(xì)粒子基因組DNA。
[0024] 上述方法中，所述濾膜碎片的大小可為0. 2-lcm2,具體可為0. 5cm2。
[00巧]上述方法中，所述利用±壤微生物DNA的提取方法提取所述濾膜碎片上的基因組DNA可用±壤提取試劑盒進(jìn)行。所述±壤提取試劑盒具體可為MP公司的±壤基因組DNA提 取試劑盒（FastDNA?SpinKitforSoi1)，產(chǎn)品目錄為 116560200。
[0026] 本發(fā)明中，所述離屯、可在4°C、200Xg下進(jìn)行；所述離屯、時(shí)間可為1小時(shí)。
[0027] 上述方法中，所述大氣細(xì)粒子是指空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑小于等于10ym的顆粒。
[0028] 上述方法中，用采樣濾膜采集大氣細(xì)粒子可按照常規(guī)方法進(jìn)行，如用帶有采樣濾 膜的大氣顆粒物采樣器將大氣細(xì)粒子采集于采樣濾膜上。
[0029] 實(shí)驗(yàn)證明，利用大氣細(xì)粒子基因組DNA的提取方法每毫克大氣細(xì)粒子可W得到 0. 0333yg的基因組DNA;利用大氣細(xì)粒子基因組DNA的提取方法提取得到的PM2.5基因組 DNA的量與采集得到PM2.5的量呈現(xiàn)較好的正相關(guān)，采集得到PM2.5顆粒越多，提取得到PM2.5 基因組DNA越多；PCR-凝膠電泳檢測(cè)法與分光光度檢測(cè)法的檢測(cè)結(jié)果顯示利用大氣細(xì)粒子 基因組DM的提取方法得到的DM質(zhì)量好，可W進(jìn)行進(jìn)一步的分子實(shí)驗(yàn)。
【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1為含有PMz.g的大氣采樣濾膜。其中，A1-A3為立個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，Blank為空白對(duì) 照。 陽(yáng)031] 圖2為將裁剪后的濾膜放入裝有PBS緩沖液的50mL離屯、管中后的圖片。其中， A1-A3為S個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，Blank為空白對(duì)照。
[0032] 圖3為手動(dòng)震蕩后得到PMz.g顆粒懸浮液體。其中，A1-A3為S個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，Blank 為空白對(duì)照。 陽(yáng)03引圖4為收集有PM2.日顆粒的微孔濾膜。其中，Sample為收集有PM2.5顆粒的微孔濾 膜，Blank為空白對(duì)照。
[0034] 圖5為利用±壤基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。其中，A1-A3為S個(gè)平行 實(shí)驗(yàn)，Blank為空白對(duì)照。
[0035] 圖6為提取得到的DNA產(chǎn)物經(jīng)PCR后的凝膠電泳圖。其中，A1-A3為S個(gè)平行實(shí) 驗(yàn)，Blank為空白對(duì)照，陽(yáng)性為陽(yáng)性對(duì)照，陰性為陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0037] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0038] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)條件，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為無(wú)菌條件，具體為在超凈工作臺(tái)中 進(jìn)行。
[0039] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均需經(jīng)過(guò)滅菌處理。 W41] 下述實(shí)施例中采集的大氣細(xì)粒子為PMz.e(空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑小于等于 2. 5ym)。
[0042] 下述實(shí)施例中的石英濾膜為Mu化tell公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為420065,石英濾膜 小于9X10cm2。石英濾膜需在采集大氣細(xì)粒子前，在馬弗爐中般燒，得到無(wú)菌的石英濾膜； 般燒條件為500-600°C;般燒時(shí)間為5-6小時(shí)。
[0043] 下述實(shí)施例中的PBS緩沖液為無(wú)菌憐酸鹽緩沖液，PBS緩沖液的抑為7. 2-7. 4， PBS緩沖液由Solarbio公司的10XPBS緩沖液（產(chǎn)品目錄為P1022-500)稀釋十倍得到。
[0044] 下述實(shí)施例中的超聲清洗機(jī)為昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品型號(hào)為 KQ-300D型數(shù)控超聲波清洗器。
[0045] 下述實(shí)施例中的可換膜針頭式過(guò)濾器（SwinnexFi