成人干細(xì)胞的體外擴(kuò)增的制作方法
【專利說明】成人干細(xì)胞的體外擴(kuò)增 相關(guān)申請的交叉引用
[0001] 本申請要求2013年3月11日提交的美國臨時(shí)申請No. 61/776, 422和2013年3 月12日提交的美國發(fā)明申請No. 13/795, 659的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，將該臨時(shí)申請和發(fā)明申請以 引用方式整體并入本文。 政府利益
[0002] 本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health)授予的編號 為5R44HL091740-03的政府資助下作出的。政府在本發(fā)明中具有某些權(quán)利。 序列表、表格或計(jì)筧機(jī)稈序表的引用
[0003] 本申請隨電子格式的序列表一起提交。該序列表作為2014年3月10日創(chuàng)建的標(biāo) 題為"106417-0182_5叫_1^5^.丨#"的文件提供，大小為101?字節(jié)。電子格式的該序列表 中的信息以引用方式整體并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本文提供涉及長期干細(xì)胞、產(chǎn)生這類細(xì)胞的方法以及各種蛋白質(zhì)構(gòu)建體的實(shí)施 例。
【背景技術(shù)】
[0005] 長期造血干細(xì)胞（LT-HSC)是存在于成人骨髓中并產(chǎn)生全部成熟紅細(xì)胞組庫的稀 有祖細(xì)胞。這些細(xì)胞對于所有紅細(xì)胞區(qū)室的維持是必要的。在針對惡性血液病、自身免疫 性和免疫缺陷等的療法中，干細(xì)胞移植可以是一種有用的輔助療法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 在一些實(shí)施例中，提供一種產(chǎn)生條件性無限增殖化成人干細(xì)胞群體的方法。該方 法可包括向一種或多種成人干細(xì)胞提供外源合成的能促進(jìn)細(xì)胞存活或增殖中的一者或多 者的Myc多肽和外源合成的能抑制凋亡的Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽。在一些實(shí)施例中，該Myc多 肽以至少約72小時(shí)的時(shí)間間隔提供給該一種或多種成人干細(xì)胞并且該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽 以至少約96小時(shí)的時(shí)間間隔提供給該一種或多種成人干細(xì)胞，以產(chǎn)生條件性無限增殖化 成人干細(xì)胞群體。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的頻率不 超過每小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的頻率不 超過每兩小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的頻率 不超過每三小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的頻 率不超過每四小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的 頻率不超過每五小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽 的頻率不超過每六小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多 肽的頻率不超過每七小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc 多肽的頻率不超過每八小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc 多肽的頻率不超過每九小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc 多肽的頻率不超過每十小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc 多肽的頻率不超過每^^一小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該 Myc多肽的頻率不超過每十二小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或 該Myc多肽的頻率不超過每十三小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/ 或該Myc多肽的頻率不超過每十四小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽 和/或該Myc多肽的頻率不超過每十五小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域 多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每十六小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié) 構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每十七小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2 結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每十八小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該 Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每十九小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng) 該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每二十小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中， 供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每二^^一小時(shí)一次。在一些實(shí)施 例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每二十二小時(shí)一次。在一 些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每二十三小時(shí)一次。 在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每二十四小時(shí) 一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每三十六 小時(shí)一次。在一些實(shí)施例中，供應(yīng)該Bcl-2結(jié)構(gòu)域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每 四十八小時(shí)一次。
[0007] 在一些實(shí)施例中，提供Myc融合蛋白。該融合蛋白包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、能促進(jìn)細(xì) 胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽、V5結(jié)構(gòu)域和六組氨酸表位標(biāo)簽。
[0008] 在一些實(shí)施例中，提供干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基。該擴(kuò)增培養(yǎng)基包含IL3、IL6、干細(xì)胞因 子、促血小板生成素、Flt3-L和GM-CSF。
[0009] 在一些實(shí)施例中，提供Myc融合蛋白。該Myc融合蛋白包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、能促 進(jìn)細(xì)胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽。該Myc融合蛋白的半壽期超過約60分鐘。
[0010] 在一些實(shí)施例中，提供編碼本文公開的任何蛋白質(zhì)的核酸。
[0011] 在一些實(shí)施例中，提供包含本文提供的任何核酸的載體。
[0012] 在一些實(shí)施例中，提供包含本文提供的任何載體或核酸的細(xì)胞。
【附圖說明】
[0013] 各個(gè)實(shí)施例的特征在所附的權(quán)利要求書中以具體特征闡述。通過參考下文的"具 體實(shí)施方式"和附圖，將獲得對本發(fā)明一些實(shí)施例的特征和優(yōu)點(diǎn)的更好的理解，在"具體實(shí) 施方式"中闡述利用各個(gè)實(shí)施例的原理的示例性實(shí)施例，而在附圖中：
[0014] 圖1A、1B、1C、ID和IE顯示Tat融合蛋白的產(chǎn)生和體外表征的示例性實(shí)施例。圖 IA顯示Tat-Myc融合蛋白和Tat-Bcl-2融合蛋白的示意圖的示例性實(shí)施例，包括HIV-ITat 的框內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域及V5和6xHis標(biāo)簽的位置。圖IB顯示從大腸桿菌（E. coli)純化、 經(jīng)SDS-PAGE分離并用考馬斯染色后的重組蛋白的示例性實(shí)施例。圖IC顯示暴露于純化 的重組Tat-Myc、Tat-Bcl-2或保持未處理（NT)達(dá)兩小時(shí)，然后用抗V5的單克隆抗體并用 Hoechst 9934核染劑固定和染色的匯合3T3細(xì)胞的菌苔的示例性實(shí)施例。Tat-Myc蛋白 在這個(gè)時(shí)間范圍主要定位于核區(qū)域，而Tat-Bcl-2保持在細(xì)胞質(zhì)和核周空間。圖ID顯示 經(jīng)如下處理的源自人臍帶血的HSC的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析（抗V5和β -肌動(dòng)蛋白 的單克隆抗體）：利用Tat-Myc的單次暴露來沖擊致敏1小時(shí)，洗滌，然后裂解（在指定的 時(shí)間點(diǎn)）以將質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)級分與核級分分離。圖IE顯示經(jīng)如下處理的源自人臍帶血的 HSC的核級分的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析（抗V5和β-肌動(dòng)蛋白的單克隆抗體）：利用 Tat-Myc的單次暴露來沖擊致敏2小時(shí)，洗滌，然后裂解（在指定的時(shí)間點(diǎn)）以將質(zhì)膜和細(xì) 胞質(zhì)級分與核級分分離。該蛋白質(zhì)的大部分在24小時(shí)至48小時(shí)之間失去。在72小時(shí)后 的任何時(shí)間點(diǎn)沒有剩余可檢測的蛋白質(zhì)。
[0015] 圖2A、2B、2C和2D顯示表明重組Tat-Myc和Tat-Bcl-2具有生物活性的示意圖的 示例性實(shí)施例。圖2A和2B顯示在單獨(dú)培養(yǎng)基（無處理，NT)、補(bǔ)加有Tat-Cre (Tat對照， TC)或遞增濃度的Tat-Myc(TM)(圖2A)或Tat-Bcl-2 (TB)(圖2B)的培養(yǎng)基中再次平板接 種48小時(shí)的體外活化T細(xì)胞的示意圖的示例性實(shí)施例。還顯示了起始細(xì)胞群體中的活細(xì)胞 的頻率（淺灰色柱條）。圖2C和2D顯示進(jìn)一步用Tat-Myc溫育并用CFSE標(biāo)記的活化T細(xì) 胞的示意圖的示例性實(shí)施例，表明該活化T細(xì)胞保持母細(xì)胞化表型（blasting phenotype) (圖2C)并且去除抗原刺激和外源添加的細(xì)胞因子后繼續(xù)增殖（圖2D)。
[0016] 圖3A、3B和3C顯示鼠 HSC在體外用Tat-Myc和Tat-Bcl-2擴(kuò)增的示意圖的示例 性實(shí)施例。圖3A顯示具有c-Kit+、Sca-I+表型并且呈現(xiàn)譜系標(biāo)志物（Mac-1、Gr-1、B220、 ⑶3、Ter-119和Flk-2)陰性的所得細(xì)胞群體的FACS分析的坐標(biāo)圖的示例性實(shí)施例。圖3B 顯示與在沒有添加 Tat融合蛋白的培養(yǎng)物中的HSC (淺灰色，最右邊的跡線）相比，HSC在 體外用Tat-Myc和Tat-Bcl-2進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)的增殖（深灰色，最左邊的跡線）的示意圖的示 例性實(shí)施例。圖3C顯示在具有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的培養(yǎng)物中體外細(xì)胞擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué) 的示意圖的示例性實(shí)施例。
[0017] 圖4A、4B、4C和4D顯示用Tat-Myc和Tat-Bcl-2擴(kuò)增的鼠 Ptlt-HSC在體內(nèi)的功 能分析的示意圖的示例性實(shí)施例。幾群經(jīng)亞致死性輻照的Rag-I /小鼠被給予10 3個(gè)源自 從野生型C57BL/6J小鼠獲得的骨髓細(xì)胞的ptlt-HSC。圖4A顯示與Rag-I /對照（第一小 圖）相比，來自Ptlt-HSC嵌合小鼠（第二小圖）的外周血中成熟B細(xì)胞的存在的FACS分 析（⑶19/B220表達(dá)）的示意圖的示例性實(shí)施例。圖4B顯示與Rag-I /對照（第一小圖） 相比，Rag-1 / ptlt-HSC嵌合小鼠（第二小圖）的外周血中成熟T細(xì)胞的存在的FACS分析 (TCR β /⑶4表達(dá)）的示意圖的示例性實(shí)施例。圖4C顯示來自Rag-1 / ptlt-HSC嵌合小鼠的 淋巴器官（脾臟、胸腺、淋巴結(jié)和骨髓）中的發(fā)育中的T細(xì)胞和B細(xì)胞的FACS分析（CD19/ IgM和CD8/CD4表達(dá)）的示意圖的示例性實(shí)施例。圖4D示出的數(shù)據(jù)證明成熟淋巴樣細(xì)胞在 經(jīng)它們的抗原受體活化后能夠母細(xì)胞化并進(jìn)行細(xì)胞分裂。
[0018] 圖5A、5B、5C、ro和5Ε顯示用Tat-Myc和Tat-Bcl-2擴(kuò)增源自人臍帶血細(xì)胞的HSC 的示意圖的示例性實(shí)施例。圖5A顯示在體外擴(kuò)增14天的人臍帶血細(xì)胞的表面表型的FACS 分析的不意圖的不例性實(shí)施例（頂部各小圖僅用細(xì)胞因子混合物；底部各小圖用補(bǔ)加有 Tat-Myc和Tat-Bcl-2的細(xì)胞因子混合物）。圖5B顯示在兩組條件下⑶34+細(xì)胞的體外擴(kuò) 增的動(dòng)力學(xué)的示意圖的示例性實(shí)施例。圖5C顯示源自人ptlt-HSC的、在甲基纖維素測定 法中在支持髓類紅細(xì)胞分化的條件下發(fā)育的三種不同集落類型的圖像的示例性實(shí)施例。圖 顯示在接種了 IO3個(gè)用細(xì)胞因子混合物培養(yǎng)的臍帶血細(xì)胞（FCB)UO 3個(gè)用補(bǔ)加 Tat-Myc 和Tat-Bcl-2的細(xì)胞因子混合物培養(yǎng)的臍帶血細(xì)胞（FCB+TMTB)或IO4個(gè)新鮮的未經(jīng)操縱 的臍帶血細(xì)胞（ΚΓ4新鮮FCB)的甲基纖維素培養(yǎng)物中觀察到的每種集落類型的定量的示 意圖的示例性實(shí)施例。圖5E顯示再次平板接種圖f5D中所示的細(xì)胞時(shí)在甲基纖維素培養(yǎng)物 中觀察到的集落數(shù)目的定量的示意圖的示例性實(shí)施例。
[0019] 圖6A、6B、6C、6D、6E、6F和6G顯示源自人臍帶血的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)長期（ptlt)-HSC的 體內(nèi)功能分析的示意圖的示例性實(shí)施例。圖6A顯示幾群被給予如下移植物的經(jīng)亞致死性 輻照的NSG小鼠的骨髓的FACS分析的示意圖的示例性實(shí)施例：106個(gè)在細(xì)胞因子混合物中 體外擴(kuò)增的臍帶血細(xì)胞（第一小圖；FCB)，或IO6個(gè)在補(bǔ)加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的細(xì)胞 因子混合物中擴(kuò)增的臍帶血細(xì)胞（第二小圖；FCB TMTB)，或5X IO6個(gè)新鮮的未經(jīng)操縱的 臍帶血細(xì)胞（第三小圖；新鮮FCB)。圖6B顯示來自異種嵌合小鼠的骨髓、脾臟和胸腺細(xì)胞 的FACS分析的示意圖的示例性實(shí)施例。對所有細(xì)胞的人CD45進(jìn)行染色。對CD45+細(xì)胞設(shè) 門，顯示出骨髓中的人CD34+CD38lci細(xì)胞（第一小圖；骨髓）；脾臟中的人CD19+和人CD3+ 淋巴細(xì)胞（第二小圖；脾臟）；和胸腺中的人CD3+細(xì)胞（第三小圖；胸腺）。圖6C顯示用 CFSE標(biāo)記并在抗人CD40和IgM的單克隆抗體存在下培養(yǎng)的人脾臟B細(xì)胞的FACS分析的 示意圖的示例性實(shí)施例。在NSG異種嵌合小鼠中發(fā)育的人B細(xì)胞在它們的抗原受體刺激后 發(fā)生增殖。圖6D顯示來自從NSG異種嵌合小鼠的骨髓獲得并在甲基纖維素上平板接種的 人CD34+CD38lci細(xì)胞的髓類紅細(xì)胞集落的定量的示意圖的示例性實(shí)施例。圖6E顯示再次平 板接種后髓類紅細(xì)胞集落的發(fā)育的定量的示意圖的示例性實(shí)施例。圖6F顯示在細(xì)胞因子 混合物（空心圓圈）或補(bǔ)加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的細(xì)胞因子混合物（黑色正方形）中 體外擴(kuò)增的CD45陽性骨髓細(xì)胞群體中的髓樣細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞分化（CD 11b、CD33、CD3和 ⑶19表達(dá)）的定量的示意圖的示例性實(shí)施例。圖6G顯示在細(xì)胞因子混合物（空心圓圈） 或補(bǔ)加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的細(xì)胞因子混合物（黑色正方形）中體外擴(kuò)增的⑶45陽 性脾臟細(xì)胞群體中的髓樣細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞分化（⑶11b、⑶33、⑶3和⑶19表達(dá)）的定量 的示意圖的示例性實(shí)施例。
[0020] 圖 7A、7B、7C、7D、7E、7F 和 7G 顯示用 Tat-Myc 和 Tat-Bcl-2 體外擴(kuò)增成人 G-CSF 動(dòng) 員的HSC的示意圖的示例性實(shí)施例。圖7A顯示人CD45+細(xì)胞的表面表型的示意圖的示例性 實(shí)施例，表明了人⑶34+級分和⑶38+級分的富集。圖7B顯示在Tat-Myc和Tat-Bcl-2存 在下在培養(yǎng)物中進(jìn)行體外細(xì)胞擴(kuò)增18天時(shí)間的動(dòng)力學(xué)的示意圖的示例性實(shí)施例。圖7C顯 示表明了 5X103個(gè)用Tat-Myc和Tat-Bcl-2在體外擴(kuò)增的成人G-CSF HSC在甲基纖維素中 產(chǎn)生4種形態(tài)學(xué)上不同的集落類型的示意圖的示例性實(shí)施例。圖7D顯示表明了用Tat-Myc 和Tat-Bcl-2在體外擴(kuò)增的成人G-CSF HSC在異種嵌合NSG小鼠中產(chǎn)生人造血譜系的FACS 分析的示意圖的示例性實(shí)施例。骨髓來自移植了用補(bǔ)加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的細(xì)胞因 子混合物（第一小圖；G-CSF+TMTB)或用新鮮的未經(jīng)操縱的臍帶血細(xì)胞（第二小圖；新鮮 FCB)擴(kuò)增的ptlt-HSC的NSG小鼠。圖7E顯示來自骨髓、脾臟和胸腺的細(xì)胞的FACS分析 的示意圖的示例性實(shí)施例。骨髓細(xì)胞包括人CD45細(xì)胞（它們也是人CD34+和CD38+)(第 一小圖）、脾臟細(xì)胞包括人CD45細(xì)胞（也對它們的人CD3進(jìn)行染色）（第二小圖）；胸腺細(xì) 胞包括人⑶45細(xì)胞及⑶3 (第三小圖）。圖7F和7G顯示對植入了 IO6個(gè)在補(bǔ)加 Tat-Myc 和Tat-Bcl-2的細(xì)胞因子混合物中（黑色正方形）體外擴(kuò)增的G-CSF動(dòng)員細(xì)胞的一群異種 嵌合小鼠進(jìn)行髓樣細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞分化評估的示意圖的示例性實(shí)施例。對骨髓細(xì)胞（圖 7F)和脾臟細(xì)胞（圖7G)的⑶45陽性群體分析⑶11b、⑶33、⑶3和⑶19表達(dá)。
[0021] 圖8顯示用CFSE標(biāo)記并分別在抗小鼠⑶3或⑶40和IgM的單克隆抗體存在下培 養(yǎng)的小鼠脾臟T細(xì)胞和B細(xì)胞的FACS分析的示意圖示例性實(shí)施例。在移植了來自5FU處 理的C57BL. 6的擴(kuò)增HSC的Ragl-/-小鼠中發(fā)育的小鼠 T細(xì)胞（第一小圖，最左邊的淺灰 色線條）和B細(xì)胞（第二小圖，最左邊的淺灰色線條）與未經(jīng)刺激的細(xì)胞（最右邊的深灰 色線條）相比，在它們的抗原受體刺激后發(fā)生增殖。
[0022] 圖9A和9B顯示各種Myc融合蛋白構(gòu)建體在活化T細(xì)胞活力測定中的活性的示例 性實(shí)施例。圖9A顯示一些代表性的Myc融合蛋白構(gòu)建體的示例性概略性比對。圖9B顯示 在用代表性的Myc融合蛋白構(gòu)建體處理后48小時(shí)活T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的示意圖的示例性實(shí)施 例。
[0023] 圖10A、10B、IOC和IOD顯示各種Tat融合蛋白（各為50 μ g/ml)在活化T細(xì)胞活 力測定中的活性的示例性實(shí)施例。圖IOA顯示來自未經(jīng)處理的細(xì)胞（無處理）的FACS分 析（前向和側(cè)向散射）的活門（live gate)的示意圖的示例性實(shí)施例。圖IOB顯示來自經(jīng) Tat-Cre處理的細(xì)胞（Tat-Cre對照）的FACS分析（前向和側(cè)向散射）的活門的示意圖的 示例性實(shí)施例。圖IOC顯示來自經(jīng)Tat-Bcl2處理的細(xì)胞（Tat-Bcl2)的FACS分析（前向 和側(cè)向散射）的活門的示意圖的示例性實(shí)施例。圖IOA顯示來自經(jīng)Tat-Myc處理的細(xì)胞 (Tat-Myc)的FACS分析（前向和側(cè)向散射）的活門的示意圖的示例性實(shí)施例。
[0024] 圖11顯示在多種細(xì)胞因子存在下并且在有或沒有PTD融合蛋白的情況下擴(kuò)增的 CD34+細(xì)胞的數(shù)目的示意圖的示例性實(shí)施例。
[0025] 圖12顯示來自接受了 5ΧΚΓ6個(gè)在單獨(dú)FCB培養(yǎng)基（頂部小圖）或補(bǔ)加有 Tat-Myc和Tat-Bcl2的FCB培養(yǎng)基（左下小圖）中擴(kuò)增的細(xì)胞的NSG小鼠的、對人⑶45染 色的骨髓細(xì)胞的FACS分析的示意圖的示例性實(shí)施例。注意在接受了用Tat-Myc和Tat-Bcl2 處理的細(xì)胞的小鼠中人CD45+細(xì)胞的增加。CD45+細(xì)胞進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析以 確定CD34陽性細(xì)胞的存在（右下小圖）。
[0026] 圖13顯示來自接受了 5ΧΚΓ6個(gè)在單獨(dú)FCB培養(yǎng)基（頂部小圖）或補(bǔ)加有 Tat-Myc和Tat-Bcl2的FCB培養(yǎng)基（左下小圖）中擴(kuò)增的細(xì)胞的NSG小鼠的、對人⑶45染 色的脾臟細(xì)胞的FACS分析的示意圖的示例性實(shí)施例。注意在接受了用Tat-Myc和Tat-Bcl2 處理的細(xì)胞的小鼠中人CD45+細(xì)胞的增加。CD45+細(xì)胞進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析以 確定CD19和CD3陽性細(xì)胞的存在（右下小圖）。
[0027] 圖14顯示來自接受了 5ΧΚΓ6個(gè)在單獨(dú)FCB培養(yǎng)基（頂部小圖）或補(bǔ)加有 Tat-Myc和Tat-Bcl2的FCB培養(yǎng)基（左下小圖）中擴(kuò)增的