Sclerotiorin衍生物及其制備方法與作為抗甲型H1N1流感病毒劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種Sclerotiorin衍生物及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及一種對 甲型HlNl流感病毒具有極強(qiáng)的抑制活性的Sclerotiorin衍生物及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲型HlNl流感病毒是A型流感病毒，攜帶有HlNl亞型豬流感病毒毒株，包含有禽 流感、豬流感和人流感三種流感病毒的核糖核酸基因片斷，同時(shí)擁有亞洲豬流感和非洲豬 流感病毒特征。自2009年3月18日在墨西哥爆發(fā)甲型HlNl流感病毒以來，已經(jīng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn) 感染、死亡病例。因此，尋找安全高效的抗甲型HlNl流感病毒劑成為國際上急需解決的課 題。海洋天然產(chǎn)物被認(rèn)為是新型抗病毒劑的重要來源。海洋微生物由于在實(shí)驗(yàn)室中可以 大規(guī)模發(fā)酵，不易破壞自然環(huán)境，而成為活性海洋化合物的最重要來源。然而，近年來尚未 見到直接從海洋微生物中來源的天然化合物或其衍生物作為抗甲型HlNl流感病毒劑的應(yīng) 用。
[0003] (Centers for Disease Control and Prevention. Update ：novel influenza A(HlNl)virus infections-worldwide, May 6,2009.MMffR Morb Mortal Wkly Rep. 2009, 58,453_458;Scalera，N.M. ;Mossad，S.B. Postgrad Med. 2009，121，43_47 ;Medina，R. A.; Garcia-Sastre，A. Nat. Rev. Microbiol. 2011，9, 590-603.) D

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種來源于海洋真菌的Sclerotiorin衍生物的制備方法 與作為抗甲型HlNl流感病毒劑的應(yīng)用，它能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。菌種保藏信息：保 藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址：北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期：2014年4月3日；保藏編 號：CGMCC No. 8994 ;分類命名：Penicillium sp. 〇
[0005] 本發(fā)明提供式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：
或其藥學(xué)上可接受的鹽。式I中R為

本發(fā)明提供式I化合物的制備方法，其特征在于先在菌 種培養(yǎng)基中對分離自柳珊瑚的內(nèi)生真菌Penicillium sp. (TA33-1)進(jìn)行菌種培養(yǎng)，再在發(fā) 酵培養(yǎng)基中對該真菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將所得菌絲體用氯仿-甲醇混合液（I : 1)浸提3次 減壓濃縮后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏分別進(jìn)行正相硅膠柱層析、 S印hadex LH-20凝膠柱層析后，再經(jīng)HPLC高效液相制備色譜，將所得洗脫液濃縮，得黃色 粉末，即為（+)-Sclerotiorin ;在溶有（+)-Sclerotiorin的二氯甲燒溶液中，加入有機(jī)伯 胺和碳酸鉀，反應(yīng)后得到式I化合物。
[0007] 上述制備方法中菌種培養(yǎng)基優(yōu)選含有葡萄糖0. 1 %-5.0% (重量百分比，下 同）、酵母膏 0.01 % -1 %、蛋白胨 0.01 % -1 %、瓊脂 〇· 1% -3.0%、氯化鈉 0.05% -5%， 其余為水，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為0-30 °C，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為3-15天；發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選含有 大米1.0% -80. 0% (重量百分比，下同）、氯化鈉0.05% -5%，其余為水，培養(yǎng)溫度 優(yōu)選為0-30°C，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為10-60天；所述的正相硅膠柱層析采用的固定相 優(yōu)選200-300目硅膠，流動相優(yōu)選體積比為15 % -60 %的乙酸乙酯-石油醚混合溶 劑；所述Sephadex LH-20凝膠柱層析采用的流動相優(yōu)選體積比為石油醚：氯仿： 甲醇=2 : I : 1的混合溶劑；所述HPLC高效液相制備色譜中采用的色譜柱為本 領(lǐng)域常規(guī)ODS C18柱，優(yōu)選為Kromasil 10 X 250_，5 μ m，流速優(yōu)選為1. 0-5. OmL/ min，流動相優(yōu)選體積比為50% -80 %的甲醇-水混合溶劑；所述的有機(jī)伯胺為
[0008] 本發(fā)明從海洋真菌中獲得的Sclerotiorin衍生物對甲型HlNl流感病毒具有極強(qiáng) 的抑制活性，可用于開發(fā)抗甲型HlNl流感病毒劑，應(yīng)用前景廣闊。
[0009] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗甲型 HlNl流感病毒劑中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明中術(shù)語"藥學(xué)上可接受的鹽"是指非毒性的無機(jī)或有機(jī)酸和/或堿的加成 鹽?？蓞⒁?Salt selection for basic drugs"，Int. J.Pharm. (1986)，33,201_217〇
【具體實(shí)施方式】 toon] 為了便于對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，下面提供的實(shí)施例對其做了更詳細(xì)的說明。但 是這些實(shí)施例僅供更好的理解發(fā)明而并非用來限定本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┰瓌t，本發(fā)明的實(shí) 施方式不限于以下內(nèi)容。
[0012] 實(shí)施例1
[0013] (1)柳珊瑚內(nèi)生真菌Penicillium sp. (TA33-1)的菌種培養(yǎng)
[0014] 菌種培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有葡萄糖1. 0% (重量百分比，下同）、酵母膏0. 2%、蛋 白胨0. 2 %、瓊脂I. 0 %、氯化鈉3. 0 %，其余為水，使用時(shí)制成試管斜面，真菌菌株在30°C下 培養(yǎng)3天。
[0015] ⑵柳珊瑚內(nèi)生真菌Penicillium sp. (TA33_1)的發(fā)酵
[0016] 發(fā)酵培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有大米40. 0 % (重量百分比，下同）、氯化鈉3. 0 %，其余 為水；真菌菌株于28°C培養(yǎng)30天。
[0017] (3) (+)-Sclerotiorin 的提取分離
[0018] 取60瓶步驟（2)得到的菌絲體，用氯仿-甲醇混合液（I : 1)浸提3次減壓濃縮 后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏分別進(jìn)行正相硅膠柱層析（固定相為 200-300目硅膠；流動相為30%乙酸乙酯/石油醚混合溶劑，體積比）、5印1^(1^1^-20凝 膠柱層析（石油醚：氯仿：甲醇=2 : I : 1的混合溶劑，體積比）后，再經(jīng)HPLC高效液 相制備色譜分離（色譜柱為Kromasil 10X250mm，5 μπι，流速為2. OmL/min，流動相為65% 的甲醇-水混合溶劑，體積比），將所得洗脫液濃縮，得黃色粉末，即為（+)-Sclerotiorin。
[0019] 實(shí)施例2
[0020] (1)柳珊瑚內(nèi)生真菌Penicillium sp. (TA33-1)的菌種培養(yǎng)
[0021] 菌種培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有葡萄糖0. 1% -5. 0% (重量百分比，下同）、酵母膏 0. 01% -1%、蛋白胨0.01% -1%、瓊脂0. 1% -3.0%、氯化鈉0.05% -5%，其余為水，使用 時(shí)制成試管斜面，真菌菌株在0_30°C下培養(yǎng)3-15天。
[0022] (2)柳珊瑚內(nèi)生真菌 Penicillium sp. (TA33-1)的發(fā)酵
[0023] 發(fā)酵培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有大米I. 0 % -80. 0 % (重量百分比，下同）、氯化鈉 0. 05% -5%，其余為水，真菌菌株于0-30°C培養(yǎng)10-60天。
[0024] (3) (+)-Sclerotiorin 化合物的提取分離
[0025] 取10-300瓶步驟（2)所得的將所得菌絲體用氯仿-甲醇混合液（I : 1)浸提3 次減壓濃縮后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏濃縮后分別進(jìn)行正相硅 膠柱層析（固定相為本領(lǐng)域常規(guī)正相硅膠，流動相為15% -40%的乙酸乙酯-石油醚混合 溶劑，體積比）、Sephadex LH-20凝膠柱層析（流動相為石油醚：氯仿：甲醇=2 : I : 1 的混合溶劑，體積比）后，再經(jīng)HPLC高效液相制備色譜（色譜柱為本領(lǐng)域常規(guī)ODS C18柱， 流速為I. 0-5. OmL/min，流動相為50 % -80 %的甲醇-水混合溶劑，體積比），將所得洗脫液 濃縮，得黃色粉末固體，即為（+)-Sclerotiorin化合物。
[0026] 實(shí)施例1-2中未具體指明的其他菌種培養(yǎng)、發(fā)酵條件，以及正相硅膠柱色譜分離、 Sephadex LH-20凝膠柱層析分離、高效液相色譜分離等其他實(shí)驗(yàn)操作條件均為本領(lǐng)域常規(guī) 的實(shí)驗(yàn)操作條件，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要，進(jìn)行合理的選擇。
[0027] 實(shí)施例3
[0028] 稱取上述干燥后的（+)-Sclerotiorin (0· Imol)溶解在二氯甲烷中，常溫條件下， 在充分?jǐn)嚢柘聦⒂袡C(jī)伯胺（〇. 12mol)逐滴滴加到反應(yīng)溶液中，反應(yīng)1小時(shí)后，向反應(yīng)物中加 入蒸餾水（200mL)來終止反應(yīng)，用乙酸乙酯（500mL)進(jìn)行萃取，將萃取液濃縮后，進(jìn)行柱層 析，用乙酸乙酯洗脫，洗脫液濃縮，重結(jié)晶后得到式I化合物。
[0029] 實(shí)施例3中未具體指明的其他有機(jī)化學(xué)反應(yīng)條件，以及正相硅膠柱色譜分離等其 他實(shí)驗(yàn)操作條件均為本領(lǐng)域常規(guī)的實(shí)驗(yàn)操作條件，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要， 進(jìn)行合理的選擇。
[0030] 式I化合物的具體化合物結(jié)構(gòu)實(shí)例：
[0031]
[0032] 式I化合物的結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)：
[0033] I :? NMR(600MHz，CDC13) δΗ 7.84(lH，s，H-l)，7. 16(lH，s，H-4)，6.98(lH，d，J = 15. 6Hz, H-10), 6. 58 (1H, t, J = 2. 4Hz), 6. 41 (2H, d, J = I. 8Hz), 5. 70 (1H, d, J = 15. 6Hz, H-9)，5. 68 (1H，d，J = 9. 6Hz，H-12)，3. 83 (6H，s)，2. 42 (1H，m，H-13)，2. 18 (3H，s，H-20)， I. 59 (3H，s，H-17)，I. 57 (3H，s，H-18)，I. 42 (1H，m，H-14)，I. 32 (1H，m，H-14)，I. 00 (3H，d， J = 6. 6Hz，H-16)，0· 85(3H，t，J = 7. 2Hz，H-15). 13C NMR(150MHz，CDCl3) δ c 193. 9(C-6)， 184. 7 (C-8)，170. 3 (COCH3)，161. 8,161. 8,147. 9 (C-I)，147. 4,144. 2,143. 2,141. 8,141. 1， 132. O(C-Il)，116. 2(C-9)，114. 3(C-5)，109. 6,109. 6,109. 6,103. 3(C-8a)，101. 8(C-4)， 84. 9 (C-7)，56. 0 (-OCH3)，55. 9 (-OCH3)，35. I (C-13)，30.1 (C-14)，23. 3 (C-18)，20. 4 (C-16)， 20. 3(C0CH3),12. 5(C-17),12. l(C-15).ESIMSm/z 526. 05/528. 05[M+H]7[M+H+2]+ (3 ： I), 547. 99/550. 01[M+Na]+/[M+Na+2] + (3 ： I), 1072. 84/1072. 77[2M+Na]7[2M+Na+2]+ (3 ： I). HRESIMSm/z526. 1981 [M+H]+ (calcd for C29H33O6NCl, 526. 1991).
[0034] 2 :? NMR(600MHz，CDC13) δΗ 7.85(lH，s，H-l)，7. 16(lH，s，H-4)，6.99(lH，d，J = 15. 6Hz，H-10)，6. 50 (2H，s)，5. 68 (2H，overlapped，H-9and H-12)，3. 91 (3H，s)，3. 87 (6H， s)，2. 42 (1H，m，H-13)，2. 19 (3H，s，H-20)，I. 59 (3H，s，H-17)，I. 57 (3H，s，H-18)，I. 42 (1H，m， H-14)，L32(lH，m，H-14)，1.00(3H，d，J = 6.6Hz，H-16)，0.85(3H，t，J = 7.2Hz，H-15).13C 匪R(150MHz，CDCl3) δ c 193. 9 (C-6)，184. 7 (C-8)，170. 4 (COC