一株具有益生特征的羅伊氏乳桿菌菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物及其應(yīng)用領(lǐng)域，具體設(shè)及一株具有益生特征的羅伊氏乳桿菌菌 株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 飼料中使用抗生素在促進畜禽生長的同時，其弊端日益明顯，包括：耐藥菌株的產(chǎn) 生和流行、引起機體內(nèi)源感染或二重感染、導(dǎo)致機體免疫功能下降、藥物在畜產(chǎn)品中殘留并 通過食物鏈影響人類健康和生態(tài)環(huán)境。2012年中國年產(chǎn)抗生素達21萬噸，其中有近半被用 于了畜牧養(yǎng)殖業(yè)，國內(nèi)抗生素用量分別超出美國的4倍W上、部分歐盟國家10倍W上。由 于大量使用抗生素導(dǎo)致畜禽腸道內(nèi)微生物產(chǎn)生大量耐藥基因，運些耐藥基因隨糞便一起被 排泄到外界環(huán)境。一項最新研究發(fā)現(xiàn)，在施用養(yǎng)殖場糞肥后，中國商用養(yǎng)豬場周圍±壤中抗 生素耐藥基因的種類和濃度超出森林±壤。攜帶耐藥基因微生物可隨著河流、地下水或者 農(nóng)產(chǎn)品被擴散，給人類帶來潛在健康危險。2002年世界衛(wèi)生組織已提出減少食用動物中抗 生素使用的全球原則，歐盟已于2006年禁止在飼料中使用抗生素，美國也將于2015年禁止 在飼料中使用抗生素。我國也制訂了禁止和逐步淘汰絕大部分飼用抗生素政策和措施，《中 國飼料工業(yè)1996~2020年發(fā)展戰(zhàn)略》和《生產(chǎn)綠色食品的飼料添加劑使用準則》中也明確 規(guī)定了今后我國飼料生產(chǎn)和發(fā)展的方向，將逐步控制或減少傳統(tǒng)抗生素在飼料中添加的種 類和數(shù)量，促進我國畜牧業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。隨著《飼料和飼料添加劑管理條例》和《飼料 原料目錄》的正式實施，禁用飼用抗生素也將進入實施階段，因此開發(fā)合適抗生素替代品成 為當前最迫切任務(wù)。
[0003] 目前，國內(nèi)外公認的飼料中抗生素替代品包括微生態(tài)益生菌制劑、抗菌膚、酶制 劑、中草藥、植物提取物和酸化劑等6大類，在多種抗生素替代品中，益生菌由于在免疫功 能調(diào)節(jié)、腸道炎癥性疾病治療、腸道應(yīng)激綜合征和腹瀉防治等方面發(fā)揮重要作用日益受到 重視。目前市面上在售的益生菌類產(chǎn)品質(zhì)量良莽不齊，普遍存在菌種來源不明、宿主特異性 差、功能不明確，甚至存在魚目混珠現(xiàn)象。
[0004] 動物腸道中寄住中大量微生物，其中乳酸桿菌是在動物消化道中為主要有益菌 群，其在維持腸道健康、促進機體免疫系統(tǒng)的發(fā)育與成熟等方面發(fā)揮重要作用。豬腸道中 乳酸桿菌有嗜酸乳酸桿菌（Xactobacillusacido地ilus)、羅伊氏乳桿菌（Xactobacillus reuteri)、植物乳酸桿菌(Xactobacillusplantarum)、纖維二糖乳酸桿菌(Xactobacillus cellobiosus)、發(fā)酵乳酸桿菌(Xactobacillusfermentum)、唾液乳酸桿菌(Xactobacillus salivirius)、短乳酸桿菌（Xactobacillusbrevis)等。羅伊氏乳桿菌（X.reuteri) 是目前已報道的幾乎天然存在于所有脊椎動物和哺乳動物腸道內(nèi)的乳酸菌，對腸黏膜 上皮細胞有較強的粘附能力。L.reuteri在抗病毒方面效果非常顯著?；劝l(fā)現(xiàn)，哺 乳仔豬飼喂L.reuteriHY25101菌株后能更有效預(yù)防PEDV感染。Seo等研究發(fā)現(xiàn)， Lreuteri(Probio-16)可W抑制輪狀病毒對非洲綠猴上皮細胞系TF-104感染。在治療由 輪狀病毒引起腹瀉上L.reuteri有明顯效果，尤其是兒童。L.renteri能明顯縮短由輪狀病 毒導(dǎo)致腹瀉時間，而且L.reuteri添加量越多，腹瀉停止時間越快。L.reuteri能產(chǎn)生一種 被稱為羅伊氏菌素巧euterin)的廣譜抗菌物質(zhì)，它能廣泛地抑制大腸埃希氏桿菌、鼠傷寒 桿菌、白假絲酵母菌、枯草芽抱桿菌、黃曲霉菌、空腸彎曲桿菌及產(chǎn)芽抱梭菌等病菌。Frese 等比較了來自8種不同脊椎動物的Lreuteri基因組序列，發(fā)現(xiàn)它們之間存在根本性差異， L.reuteri為適應(yīng)不同動物腸道微環(huán)境其基因組序列也發(fā)生相應(yīng)改變。因此從健康動物腸 道內(nèi)分離抗逆性強、功效突出的乳酸桿菌是篩選飼用益生菌重要途徑之一。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一株從健康動物腸 道篩選出的羅伊氏乳桿菌化actobacillus reuteri)。該乳桿菌具有益生特征，能耐酸和耐 膽鹽，抗逆性強；對腸上皮細胞粘附能力強；對豬常見致病菌具有一定的抑制作用；可抑制 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌巧TECK88)對腸上皮細胞的損傷；可促進腸上皮細胞增殖；同時在體外 腸上皮細胞模型中該乳桿菌具有較強免疫調(diào)節(jié)功能。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述的羅伊氏乳桿菌的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008]一株羅伊氏乳桿菌（Xactobacillusreuteri)，名稱為羅伊氏乳桿菌 (Lactobacillusreuteri)LR1，于2015年7月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中屯、（CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生 物研究所，保藏編號為CGMCCNo.11154。
[0009] 所述的羅伊氏乳桿菌化actobacillus reuteri)LRl的培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基采用MRS 肉湯培養(yǎng)基，P冊.5,培養(yǎng)溫度37+rC，50~70巧m震蕩培養(yǎng)24~4她。
[0010] 所述的MRS肉湯培養(yǎng)基的組成成分為：酪蛋白腺10旨/1、牛肉浸粉lOg/l、葡萄糖 20邑/1、酵母提取物5g/L、憐酸氨二鐘2g/L、構(gòu)祿酸鋼2g/L、屯水硫酸儀0. 58g/l、四水硫酸 車孟0. 25g/l、醋酸鋼5g/L、吐溫-801血/L ;抑為5. 5,121°C高壓滅菌15min，放于4°C冰箱中 備用；MRS固體培養(yǎng)基（P冊.5)只需要在滅菌前加入15g/L瓊脂即可。
[0011] 所述的羅伊氏乳桿菌化actobacillus reuteri)LRl的菌落形態(tài)：LRl菌株在平板 上菌落呈現(xiàn)灰白色或乳白色，不透明、表面光滑、凸起、邊緣整齊，直徑1~1. 5mm。（如圖1 所示）
[0012] 所述的羅伊氏乳桿菌化actobacillus reuteri)LRl具備抑制常見腸道致病菌能 力。
[0013] 所述的羅伊氏乳桿菌化actobacillus reuteri)LRl具備抑制腸毒素大腸桿菌 ETEC K88對腸上皮細胞的損傷的功能。
[0014] 所述的羅伊氏乳桿菌化actobacillus reuteri)LRl具備免疫調(diào)節(jié)功能。
[0015] 所述的羅伊氏乳桿菌化actobacillus reuteri)LRl具備促進腸上皮細胞增殖上 的功能。
[0016] 所述的羅伊氏乳桿菌化actobacillus reuteri)LRl在制備用于治療腸道疾病的 制劑中的應(yīng)用。
[0017] 所述的羅伊氏乳桿菌化actobacillus reuteri)LRl在促進腸上皮細胞增殖上的 應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果：
[0019] 本發(fā)明提供菌株是從健康動物腸道中分離得到，安全性高，該菌株具有很好耐酸、 耐膽鹽能力，抗逆性強，該菌株對常見豬致病菌有較強抑制能力，其能通過黏附、競爭占位 等方式抑制致病菌對腸上皮細胞黏附，其還可促進腸上皮細胞增殖，促進動物腸道發(fā)育成 熟，其還具有免疫調(diào)節(jié)功能。
【附圖說明】
[0020] 圖1是羅伊氏乳桿菌LRl在MRS平板上菌落形態(tài)圖。
[0021] 圖2是羅伊氏乳桿菌LRl黏附豬小腸上皮細胞系IPEC-I的結(jié)果圖。
[0022] 圖3是羅伊氏乳桿菌LRl抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88黏附豬小腸上皮細胞系 IPEC-I的結(jié)果圖。
[002引圖4是羅伊氏乳桿菌LRl促進豬小腸上皮細胞系IPEC-I增殖的結(jié)果圖。
[0024] 圖5是羅伊氏乳桿菌LRl調(diào)控IPEC-I細胞免疫細胞因子基因mRNA表達的結(jié)果圖。
[0025] 圖6是羅伊氏乳桿菌LRl調(diào)控IPEC-I細胞免疫細胞因子蛋白表達的結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[00%] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0027] 下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)實驗條件。
[0028] PBS溶液的制備方法如下：NaCl8.Og,KCl0. 2g，KH2PO4O. 24g，胞2冊〇4? 12&0 3.