微生物檢測(cè)用傳感器、其制造方法以及聚合物層的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)用傳感器、其制造方法以及聚合物層。
【背景技術(shù)】
[0002]近年，在醫(yī)療業(yè)、食品業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜產(chǎn)、養(yǎng)殖、水處理設(shè)施等方面，都高度關(guān)注微生物檢測(cè)。在食品、醫(yī)藥品、農(nóng)藥等中存在的污染微生物，即使以微量存在，對(duì)人的健康也會(huì)造成很大影響。另外，在醫(yī)院、老年護(hù)理設(shè)施中的微生物污染成為社會(huì)問(wèn)題。進(jìn)一步地，從多種抗菌商品的流通、需求的高漲可以看出，在一般家庭中也高度關(guān)注衛(wèi)生管理。例如，在食品加工廠的場(chǎng)合，對(duì)出廠的食品實(shí)施抽樣細(xì)菌檢查、對(duì)工廠內(nèi)的環(huán)境實(shí)施細(xì)菌檢查等，但是在通過(guò)培養(yǎng)法測(cè)定的情況下，需要花費(fèi)24-48小時(shí)左右才能得到結(jié)果，成為到出廠前為止的保管成本變高的重要原因，所以需要迅速的檢測(cè)方法。并且，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也是如此，例如，如果水培的培養(yǎng)液中的細(xì)菌數(shù)增加，發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)提高。通過(guò)快速掌握細(xì)菌數(shù)能夠采取迅速殺菌等措施，所以迅速的檢測(cè)方法是有效的。
[0003]由于這樣的狀況，近年，可以簡(jiǎn)單地檢測(cè)微生物污染的技術(shù)的必要性急速高漲。此夕卜，在醫(yī)療現(xiàn)場(chǎng)，必須迅速鑒定傳染病的致病病原菌，因此需要可迅速且高靈敏度地檢測(cè)病原菌的技術(shù)。作為微生物的檢測(cè)和鑒定的方法，例如有ELISA法、Western印跡法等方法。這些方法例如有:將抗體(一級(jí)抗體)與微生物固有的蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)后，進(jìn)一步將標(biāo)記的二級(jí)抗體與抗體(一級(jí)抗體)反應(yīng)，通過(guò)監(jiān)測(cè)二級(jí)抗體的化學(xué)發(fā)光或ATP的水解反應(yīng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的方法。
[0004]另外，日本專利公開(kāi)公報(bào)特開(kāi)2009-58232號(hào)(專利文獻(xiàn)I)中記載有關(guān)利用具有分子模板的聚合物的電化學(xué)性質(zhì)，檢測(cè)來(lái)自于微生物的陰離子型分子(ATP、氨基酸等)的方法。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006]專利文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)1:日本專利公開(kāi)公報(bào)特開(kāi)2009-58232號(hào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題
[0009]然而，上述方法都不是檢測(cè)微生物本身的方法。另外，ELISA法等需要針對(duì)微生物固有的蛋白質(zhì)等制作抗體，因而是不容易的。
[0010]本發(fā)明的目的在于提供可以迅速簡(jiǎn)便、高靈敏度地檢測(cè)微生物的新型微生物檢測(cè)用傳感器、其制造方法以及聚合物層。
[0011]解決技術(shù)問(wèn)題的手段
[0012]本發(fā)明提供檢測(cè)微生物的傳感器，所述傳感器具備檢測(cè)部，所述檢測(cè)部包括檢測(cè)用電極和設(shè)置在檢測(cè)用電極上的聚合物層，所述聚合物層具有與檢測(cè)對(duì)象的微生物的立體結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的三維結(jié)構(gòu)的模板；基于微生物被捕捉至該模板的捕捉狀態(tài)來(lái)檢測(cè)微生物。上述聚合物層通過(guò)以下制造方法形成:聚合工序，在作為檢測(cè)對(duì)象的微生物的存在下，將單體聚合，在檢測(cè)用電極上形成捕獲有微生物的狀態(tài)的聚合物層；以及，破壞工序，使捕獲至聚合物層的微生物的至少一部分接觸含有溶菌的酶的溶液進(jìn)行破壞。上述傳感器的優(yōu)選實(shí)施方式為:破壞工序中使用的溶液進(jìn)一步含有螯合劑。
[0013]上述傳感器的優(yōu)選實(shí)施方式為:所述傳感器還包括石英晶體諧振器(水晶振動(dòng)子)，所述石英晶體諧振器將檢測(cè)部的檢測(cè)用電極作為電極中的一個(gè)，由石英晶體諧振器的共振頻率的變化，測(cè)定聚合物層的質(zhì)量變化來(lái)檢測(cè)微生物的捕捉狀態(tài)。
[0014]上述傳感器中，上述單體優(yōu)選選自于由吡咯、苯胺、噻吩和它們的衍生物組成的組，進(jìn)一步優(yōu)選由吡咯或其衍生物組成。
[0015]在上述傳感器中，上述檢測(cè)用電極的上述聚合物層的形成面優(yōu)選為粗面。
[0016]在上述傳感器中，作為上述微生物，優(yōu)選整體或表面的電荷為負(fù)電荷過(guò)剩狀態(tài)的微生物。
[0017]另外，本發(fā)明提供檢測(cè)微生物的傳感器的制造方法，所述傳感器具備檢測(cè)部，所述檢測(cè)部包括檢測(cè)用電極和設(shè)置在檢測(cè)用電極上的聚合物層，所述聚合物層具有與微生物的立體結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的三維結(jié)構(gòu)的模板，所述制造方法包括以下工序:聚合工序，在作為檢測(cè)對(duì)象的微生物的存在下，將單體聚合，在檢測(cè)用電極上形成捕獲有微生物的狀態(tài)的聚合物層；以及破壞工序，使捕獲至聚合物層的微生物的至少一部分接觸含有溶菌的酶的溶液進(jìn)行破壞。
[0018]另外，本發(fā)明提供具有與微生物的立體結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的三維結(jié)構(gòu)的模板的聚合物層，所述聚合物層通過(guò)包括以下工序的制造方法制造:聚合工序，在微生物的存在下，將單體聚合，形成聚合物層；以及破壞工序，使捕獲至聚合物層的微生物接觸含有溶菌的酶的溶液進(jìn)行破壞。
[0019]發(fā)明效果
[0020]本發(fā)明的傳感器能夠迅速簡(jiǎn)便、高靈敏度地檢測(cè)微生物。另外，本發(fā)明的傳感器的制造方法提供可以迅速簡(jiǎn)便、高靈敏度地檢測(cè)微生物的傳感器。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1示意性地表示本發(fā)明的傳感器的聚合物層的優(yōu)選制作工序的圖，圖1(a)為聚合工序前的剖視圖，圖1(b)為聚合工序后的剖視圖，圖1(c)為破壞工序后的剖視圖。
[0022]圖2簡(jiǎn)要表示在本發(fā)明的傳感器中，目標(biāo)微生物被捕捉到模板的樣子的示意圖，圖2 (a)為表示有目標(biāo)微生物的情況下的圖，圖2(b)為表示沒(méi)有目標(biāo)微生物的情況下的圖。
[0023]圖3表示本發(fā)明的QCM傳感器的簡(jiǎn)要結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0024]圖4是綠膿桿菌的電子顯微鏡照片。
[0025]圖5是實(shí)施例1中聚合工序后的聚吡咯層表面的電子顯微鏡照片。
[0026]圖6是在實(shí)施例1的破壞工序后，用無(wú)菌水清洗后的聚吡咯層表面的電子顯微鏡照片。
[0027]圖7是在實(shí)施例2的破壞工序后，用無(wú)菌水清洗后的聚吡咯層表面的電子顯微鏡照片。
[0028]圖8表示在使用實(shí)施例1的傳感器檢測(cè)微生物時(shí)，石英晶體諧振器的共振頻率變化的圖。
[0029]圖9表示在使用實(shí)施例2的傳感器檢測(cè)微生物時(shí)，石英晶體諧振器的共振頻率變化的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]本發(fā)明的傳感器為檢測(cè)微生物的傳感器，所述傳感器具備檢測(cè)部，所述檢測(cè)部包括檢測(cè)用電極和設(shè)置在檢測(cè)用電極上的聚合物層，所述聚合物層具有與微生物的立體結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的三維結(jié)構(gòu)的模板；基于微生物被捕捉至該模板的捕捉狀態(tài)來(lái)檢測(cè)微生物。
[0031]通過(guò)包括以下工序的制造方法形成本發(fā)明的傳感器的聚合物層:聚合工序，在作為檢測(cè)對(duì)象的微生物(以下簡(jiǎn)稱“目標(biāo)微生物”)的存在下，將單體聚合，在檢測(cè)用電極上形成捕獲微生物的狀態(tài)的聚合物層；以及破壞工序，使捕獲至聚合物層的微生物的至少一部分接觸含有溶菌的酶的溶液進(jìn)行破壞。
[0032]以下參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。
[0033][傳感器中聚合物層的制作]
[0034]圖1示意性地表示本發(fā)明的傳感器的聚合物層優(yōu)選制作工序的剖視圖。圖1表示使用吡咯作為單體時(shí)的實(shí)施方式。首先，如圖1(a)所示，在接觸檢測(cè)用電極11的環(huán)境下，準(zhǔn)備含有微生物13和吡咯的溶液12。溶液12中含有的構(gòu)成聚合物層的單體的濃度可以是ImM-lOOM，微生物13的濃度可以是1-1 X 101Qcfu/ml。
[0035]在聚合工序(Stl)中，將檢測(cè)用電極11作為陽(yáng)極，對(duì)電極(未圖示)作為陰極進(jìn)行電解，通過(guò)進(jìn)行吡咯的氧化聚合反應(yīng)，在檢測(cè)用電極11上形成聚吡咯(圖1(b)中“PPy”是聚吡咯的縮寫)構(gòu)成的聚合物層14。在形成的聚合物層14中捕捉微生物13。可以認(rèn)為，因?yàn)樵诰酆瞎ば蛑?，吡咯在檢測(cè)用電極11上釋放電子，因而吡咯本身帶有正電荷，為了補(bǔ)償該正電荷，整體或表面的電荷為負(fù)電荷過(guò)剩狀態(tài)的微生物13被捕獲至聚合物層14中。
[0036]接著，如圖1(c)所示，在破壞工序(St2)中，進(jìn)行將聚合物層14捕獲的微生物13破壞的破壞工序。可以通過(guò)使含有溶菌酶等溶菌的酶的溶液接觸微生物13進(jìn)行破壞工序。通過(guò)所述破壞工序，微生物13被破壞，微生物13從聚合物層14釋放。在破壞工序中使用的溶液中，優(yōu)選進(jìn)一步含有螯合劑。作為在破壞工序中使用的螯合劑，可以列舉:H)TA(乙二胺四乙酸)、EGTA、NTA、DTPA, HEDTA等。另外，作為在破壞工序中使用的溶菌的酶，可以列舉:溶菌酶、N-乙酰胞壁質(zhì)酶、無(wú)色桿菌肽鏈內(nèi)切酶等。
[0037]通過(guò)將含有溶菌的酶的溶液用于破壞工序，可以將聚合物層14捕獲的微生物13破壞，被破壞的微生物13從聚合物層14釋放，形成模板15?？梢哉J(rèn)為，溶液中含有的螯合劑使得由溶菌的酶而帶來(lái)的溶菌作用更容易顯現(xiàn)，因此，可以解釋為:由于含有螯合劑，可以增大微生物13的破壞程度，在被破壞的同時(shí)，容易將微生物13從聚合物層14釋放。通過(guò)使用螯合劑和溶菌的酶，可以容易地提高破壞工序的效率，如下文所述，與不使用螯合劑的情況相比，可以提升傳感器的檢測(cè)靈敏度。在破壞工序中使用的溶液中的溶菌的酶的濃度優(yōu)選l-1000mg/ml。在添加螯合