一種蒼白桿菌及其生物制劑和制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蒼白桿菌及其生物制劑和制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]農(nóng)藥現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對(duì)病蟲(chóng)害的的防治是必不可少的，但同時(shí)隨著農(nóng)藥的廣泛大量地使用，也給環(huán)境造成人為的污染，農(nóng)產(chǎn)品中導(dǎo)致農(nóng)藥殘留的產(chǎn)生，直接威脅著人們的健康。我國(guó)已經(jīng)提出了“農(nóng)藥零增長(zhǎng)計(jì)劃”，目的就是減少農(nóng)藥對(duì)環(huán)境、人的影響。在減少農(nóng)殘方面，除了篩選高效低殘留的農(nóng)藥、科學(xué)施用方法、農(nóng)藥替代等技術(shù)外，生物降解也是有效的技術(shù)之一。美國(guó)科學(xué)家從上世紀(jì)60年代開(kāi)始，著手研究污染環(huán)境的異生物質(zhì)包括化學(xué)農(nóng)藥等的微生物降解，旨在通過(guò)微生物技術(shù)清除環(huán)境污染物。國(guó)內(nèi)外有許多報(bào)道將微生物作為接種劑直接接種到自然環(huán)境中，降解、清除環(huán)境中污染物成功的例子。利用微生物對(duì)農(nóng)藥污染物進(jìn)行降解和轉(zhuǎn)化有著巨大潛力，這與微生物所具備的幾個(gè)方面的特點(diǎn)有關(guān):微生物個(gè)體微小，比表面積大，代謝速度快；微生物種類(lèi)繁多，分布廣，代謝類(lèi)型多樣；微生物繁殖快、易變異、適應(yīng)性強(qiáng)；在自然界的生態(tài)系統(tǒng)中微生物可產(chǎn)生降解酶將農(nóng)藥分解為無(wú)毒的小分子化合物甚至完全礦化為二氧化碳和水；另外微生物可通過(guò)共代謝作用，加快或促進(jìn)農(nóng)藥殘留的降解速度。國(guó)內(nèi)外已分離篩選到許多降解或轉(zhuǎn)化一種或幾種農(nóng)藥的微生物類(lèi)群。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已報(bào)道的農(nóng)藥降解細(xì)菌至少有28各屬、真菌有14個(gè)屬，放線菌有5個(gè)屬。細(xì)菌主要有假單胞菌屬棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、芽跑桿菌屬(SaciWiAs)、節(jié)桿菌屬(AriAraAacter)、黃桿菌屬、黃擔(dān)保桿菌屬{Xanthomolza^)。真菌主要有曲霉屬(AspergUJua)、青霉屬{Penlcilliuii)、木霉罵(Trichoderma)和鐮刀菌屬{Fuariuni)。農(nóng)藥殘留的微生物降解技術(shù)相比于物理化學(xué)修復(fù)技術(shù)，具有經(jīng)濟(jì)、高效和無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是一個(gè)有潛力的、充滿希望的農(nóng)藥污染修復(fù)方法。農(nóng)藥的微生物降解研究受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注，在大農(nóng)業(yè)農(nóng)殘的降解和環(huán)境修復(fù)中逐步得到應(yīng)用。甲基托布津是一種高效殺菌劑農(nóng)藥，化學(xué)名為1、2 —二( 3 -甲氧碳基-2-硫脲基)苯，通用名為甲基硫菌靈。由于其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在土壤中降解半衰期較長(zhǎng)，能持久地殘留在使用部位，易致累積效應(yīng)，由于使用過(guò)量常會(huì)造成農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留。然而，目前學(xué)術(shù)界對(duì)甲基托布津殘留降解問(wèn)題生物降解研究報(bào)道較少，市場(chǎng)上也沒(méi)有可以大面積使用的甲基托布津降解劑產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明第一目的在于提供一種蒼白桿菌，第二目的在于提供一種以所述蒼白桿菌作為活性成分的生物制劑，第三目的在于提供所述以蒼白桿菌作為活性成分的生物制劑制備方法，第四目的在于提供所述蒼白桿菌作為活性成分的生物制劑的應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的蒼白桿菌為中間型蒼白桿菌(Ochrobac trum in termedium) TP 206，保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日:2014年11月21日，保藏編號(hào):CGMCC N0.10035 ;所述蒼白桿菌屬于細(xì)菌界，變形菌門(mén)，α -變形菌綱，根瘤菌目，布魯氏菌，蒼白桿菌屬。
[0005]中間型蒼白桿菌(in termedium) TP 206的獲得與鑒定:
菌株分離篩選方法:
分離培養(yǎng)基:Na2HP04 3g，ΚΗ2Ρ04 1.5g，NH4C1 0.5g，蒸餾水 500ml，瓊脂 7_8g，pH 7.0(用NaOH調(diào)節(jié))，在倒平板的時(shí)候再加入0.5ml的CaCljP MgSO 4.7Η20，終濃度為0.1 %的甲基托布津。
[0006]量取45ml水放入小三角瓶?jī)?nèi)，在121°C、20min高壓蒸汽滅菌一稱(chēng)取5g煙葉樣品放入滅菌后的小三角瓶?jī)?nèi)，放入30°C，150r/min搖床，30min后取出靜置片刻一用移液槍吸取200ul上層液于已經(jīng)倒好的的分離培養(yǎng)基平板上，用涂布器涂布均勻一放于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d—待長(zhǎng)出多個(gè)單菌落后，在操作臺(tái)內(nèi)挑選長(zhǎng)出的單個(gè)菌落于已經(jīng)裝滿1ml LB液體培養(yǎng)基的保存管內(nèi)一再放于放入30°C，150r/min搖床培養(yǎng)3d —待菌長(zhǎng)滿保存管后一加入甘油終濃度達(dá)到40%，放于-80 °C冰箱內(nèi)保藏。
[0007]分離的菌株通過(guò)液體培養(yǎng)的方法鑒定其降解甲基托布津的能力。上述分離菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，加入終濃度為200ppm的甲基托布津農(nóng)藥，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3天，取樣通過(guò)HPLC檢測(cè)方法檢測(cè)甲基托布津的殘留量。
[0008]甲基托布津的HPLC檢測(cè)方法:取lmL培養(yǎng)液，過(guò)0.22 μ m有機(jī)相濾膜，待測(cè)。色譜柱:Z0RBAX Eclipse XDB- C18 (4.6 X 250mm，5 μ m);柱溫:30.0°C ;檢測(cè)波長(zhǎng):275nm，流動(dòng)相A:CH30H，B:H20，C:CH3CN ;流速:0.7mL/min ;進(jìn)樣量:10.Ομ?，洗脫采用梯度洗脫。
[0009]菌株分離篩選結(jié)果:
通過(guò)分離和篩選得到一株能夠在3天培養(yǎng)后高效降解甲基托布津的菌株，降解率達(dá)到99.3%,該菌株分離自云南省玉溪市紅塔區(qū)煙葉表面，標(biāo)記為ΤΡ206。該菌株于2014年11月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏登記入冊(cè)的編號(hào)CGMCCΝ0.10035ο
[0010]菌株鑒定方法
降解菌株的培養(yǎng)特征及生理生化鑒定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》。和《Bergey’ sManual of Determinative Bacter1logy》進(jìn)行。菌體總DNA的提取采用高鹽法，并以總DNA為模板，擴(kuò)增降解菌株的16S rRNA基因序列。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收，進(jìn)行TA克隆后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用原核生物鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)EzBilCloud (http: //eztaxon~e.ezb1cloud.net/)進(jìn)行在線比對(duì)分析。
[0011]鑒定結(jié)果
TP 206菌株系本發(fā)明人從大量煙草葉片上篩選出來(lái)的，具有顯著降低甲基托布津含量的能力，經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列進(jìn)行鑒定，確定是中間型蒼白桿菌(ifcAraAacir?in termedium ) TP 206 菌株。
[0012]Ochrobac trum in termedium TP 206菌株主要特征為:菌體細(xì)胞為短桿狀，排列不整齊，沒(méi)有芽孢，革蘭氏染色陰性。在NA培養(yǎng)基表面菌體形成不透明的白色小菌落，表面光滑凸起，菌落干，邊緣不整齊。嚴(yán)格好氧，伏-普試驗(yàn)(V.P.)、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)呈陰性，不水解淀粉和明膠，接觸酶、氧化酶反應(yīng)、硝酸鹽還原、硫化氫試驗(yàn)呈陽(yáng)性，能夠利用葡萄糖、麥芽糖等。最適生長(zhǎng)溫度為30 °C^PpH為6.5。
[0013]本發(fā)明第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，是以所述中間型蒼白桿菌(Ochrobac trumintermedium) TP 206經(jīng)試管種培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)后制成的生物制劑。
[0014]本發(fā)明的第三目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括試管種培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)步驟，具體包括:
A、試管種培養(yǎng):將中間型蒼白桿菌(Ochrobactrum in termedium) TP 206接種到試管斜面培養(yǎng)基上，在溫度28~31°C恒溫培養(yǎng)0.5-1.5天，得試管種；
B、液體發(fā)酵培養(yǎng):將試管種接種到液體培養(yǎng)基中，在溫度28~31V下?lián)u床培養(yǎng)1~3天得到目標(biāo)物蒼白桿菌為活性成分的生物制劑。
[0015]本發(fā)明的第四目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑在修復(fù)甲基托布津殘留污染土壤中的應(yīng)用。
[0016]所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑在降解去除農(nóng)作物甲基托布津農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明人使用中間型蒼白桿菌(ifcAraAaciri/a? in termedium) TP 206，經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程，制備了甲基托布津農(nóng)藥殘留降解菌劑，該菌劑對(duì)甲基托布津殘留的降解率達(dá)到80以上，可廣泛用于土壤甲基托布津污染或農(nóng)作物甲基托布津的農(nóng)藥殘留。
[0018]本發(fā)明使用所述菌株TP206發(fā)酵生產(chǎn)的甲基托布津農(nóng)藥降解菌劑可廣泛用于土壤中甲基托布津殘留污染的修復(fù)，還可以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中直接噴灑于土壤或作物表面，可以有效降解去除甲基托布津農(nóng)藥殘留，使用方便，成本低廉。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020]本發(fā)明所述的蒼白桿菌為中間型蒼白桿菌(OcAraAacir.in termedium) TP 206，保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日:2014年11月21日，保藏編號(hào):CGMCC N0.10035 ;所述蒼白桿菌屬于細(xì)菌界，變形菌門(mén)，α -變形菌綱，根瘤菌目，布魯氏菌，蒼白桿菌屬。
[0021]本發(fā)明所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑，是以所述中間型蒼白桿菌(Ochrobac trum in termedium) TP 206經(jīng)試管種培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)后制成的生物制劑。
[0022]所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑中菌濃度為:每ml活菌數(shù)多108o
[0023]本發(fā)明所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑的制備方法，包括試管種培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)步驟，具體包括:
A、試管種培養(yǎng):將中間型蒼白桿菌(Ochrobactrum in termedium) TP 206接種到試管斜面培養(yǎng)基上，在溫度28~31°C恒溫培養(yǎng)0.5-1.5天，得試管種；
B、液體發(fā)酵培養(yǎng):將試管種接種到液體培養(yǎng)基中，在溫度28~31V下?lián)u床培養(yǎng)1~3天得到目標(biāo)物蒼白桿菌為活性成分的生物制劑。
[0024]A步驟中所述的試管斜面培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖l~3g，牛肉浸膏0.5-1.5 g，氯化鈉 0.4-0.7 g，MgS04.7H20 0.1-0.3 g，瓊脂 1.5-2 g，其余為水，pH 值為 5.5-8.0。
[0025]B步驟中所述的液體培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖1~2 g，牛肉膏0.1~0.3 g，豆餅粉
0.8-1.2g，氯化鈉 0.3-0.5 g，MgS04.7H20 0.2-0.4 g，其余為水，pH 值為 5.5-8.0。
[0026]B步驟中所述搖床的轉(zhuǎn)速為180~200rpm。
[0027]本發(fā)明所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑的應(yīng)用為所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑在修復(fù)甲基托布津殘留污染土壤中的應(yīng)用。
[0028]本發(fā)明所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑的應(yīng)用為所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑在降解去除農(nóng)作物甲基托布