一種靜注人免疫球蛋白（ph4）的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬生物制藥領域，設及一種血制品的制備工藝，具體設及一種從組分 II+III中制備靜注人免疫球蛋白（PH4)的方法。
【背景技術】
[0002] 人免疫球蛋白（immunoglobulin)是一種具有抗體活性的蛋白質，主要存在于血 漿中，也見于其它體液、組織和一些分泌液中。免疫球蛋白可分為IgG、IgA、IgM、I曲、I姐 五類，人體血清免疫球蛋白的主要成分是IgG，占總免疫球蛋白的70-75%。
[0003]人體血清免疫球蛋白IgG是初級免疫應答中最持久、最重要的抗體，僅W單體形 式存在。大多數(shù)抗菌性、抗毒性和抗病毒抗體屬于IgG，在抗感染中起到主導作用，能夠促進 單核巨隧細胞的吞隧作用，中和細菌毒素的毒性W及與病毒抗原結合使病毒失去感染宿主 細胞的能力。IgG是唯一能通過胎盤的免疫球蛋白，在自然被動免疫中起重要作用。此外， IgG還具有調理吞隧和結合SPA等作用。
[0004]人免疫球蛋白分肌注人免疫球蛋白和靜注人免疫球蛋白。臨床上廣泛使用較多的 肌注人免疫球蛋白有抗乙肝人免疫球蛋白、抗狂犬病人免疫球蛋白、抗破傷風人免疫球蛋 白等，若與抗生素合并使用，可提高對某些嚴重細菌和病毒感染的療效。
[0005] 靜注人免疫球蛋白（IVIG)是從大量健康供血者所獻血漿混合后提取而來的，含有 各種抗病毒、細菌抗原特異性抗體，具有調節(jié)中和作用，經靜脈注射后可迅速提高使受者血 液中IgG水平，故IVIG起效快，療效好，副作用少，成為臨床上人免疫球蛋白使用最頻繁、 使用量最大的的品種。IVIG最初多用于治療多種原發(fā)性免疫球蛋白缺陷癥和各種繼發(fā)性 免疫缺乏癥如免疫介導的血小板減少、川崎病等。目前，已將IVIG的臨床應用拓展到50多 種疾病如再生障礙性貧血貧血、新生兒溶血病、輸血后紫齋、特發(fā)性血小板減少性紫齋、癒 痛、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥、多發(fā)性骨髓瘤、多發(fā)性肌炎、多發(fā)性神經病，臟器腫大，艾滋 病等，在危重癥的搶救中起著越來越重要的作用。
[0006] 由于IVIG在臨床上的應用日趨廣泛，其臨床需求也大幅增加，全球IVIG消費從 1992年的19. 4噸增加至2003年的51. 6噸，2006年已達78. 2噸，按照年增長率，預計2016 年消耗的IVIG將達到129. 4噸〔中國輸血雜志2008, 21 (11) :903-905)。
[0007]長期W來國內血漿采集量嚴重不足，國內IVIG的產量遠遠滿足不了臨床需求，但 同時，國內血制品公司采用傳統(tǒng)生產工藝得率普遍較低，一般不大于2000瓶/噸血漿（2. 5 克/瓶)。
[0008] 傳統(tǒng)的生產工藝大都采用多步低溫乙醇沉淀法，如專利CN104479011A，將 I+II+III溶解后，先經兩步低溫乙醇（15%，V/V)沉淀，壓濾除去大部分雜蛋白，然后將上清 液(組分II)在中性條件下加乙醇（20%，V/V)沉淀出來，將沉淀復溶，經過超濾、透析、濃縮， 再加乙醇（2%，V/V)沉淀一次，壓濾收集上清液，再次超濾透析、濃縮加入保護劑后無菌分 裝。有少數(shù)采用低溫乙醇沉淀結合柱層析法，如專利CN103554253A，W組分II+III為起 始原料，溶解后加乙醇（18%，V/V)沉淀，壓濾收集上清液，然后透析脫醇、脫鹽，經過兩步柱 層析，收集流穿液，再次超濾、透析、濃縮，除菌過濾后解化，后除病毒過濾再無菌分裝得成 品。
[0009] 由于低溫乙醇法大都需要多次乙醇沉淀，不可避免地造成部分蛋白的變性受損， 也容易造成蛋白共沉淀現(xiàn)象，所W產品的純度不是很高，常含有較多的雜蛋白如IgA、IgM 及多聚體等；有的雖然也結合柱層析純化，但采用了兩步柱層析，使得流程復雜，得率下降。
[0010] 本發(fā)明開發(fā)了一種W組分ΙΙ+ΙΠ為起始原料，W辛酸低溫萃取技術結合一步陰 離子柱層析完成對IgG的純化，具有流程簡潔，生產周期短，純度高的優(yōu)點，產品所含的 IgA、PKA、ACA及多聚體均比傳統(tǒng)工藝大幅下降；同時由于避免了乙醇的使用，降低了蛋白 變性受損的概率，使得產品更加穩(wěn)定；本發(fā)明工藝產品得率可達2200瓶/噸血漿左右，遠高 于傳統(tǒng)低溫乙醇工藝。

【發(fā)明內容】

[0011] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種工藝先進，操作簡單，純度高、得率高、可 工業(yè)化生產的靜注人免疫球蛋白（PH4)的制備方法。
[0012] 一種從組分II+III中制備靜注人免疫球蛋白（PH4)的方法，包括如下步驟： (1) 組分II+III沉淀的懸浮 將冰凍的組分II+III沉淀從冷庫取出，切成碎塊，然后按一定的投料比，投入預先配 制的懸浮緩沖液中，均勻攬拌1-3小時，使沉淀充分懸浮分散； (2) 辛酸溶液萃取 將步驟（1)得到的懸浮液與預先配制的含辛酸的萃取液混合，攬拌2-5小時，使目標蛋 白充分溶出，得到均勻的懸浮液； (3) 壓濾 將步驟（2)得到的懸浮液在2~10°C下壓濾，濾板采用PA化公司生產的Supra化r50P濾板；收集濾液，即為粗純的IgG溶液；及時在濾液中加入甘氨酸1-3% (w/w)，充分攬拌使 其溶解； (4) 陰離子交換柱層析 步驟（3)得到的IgG溶液上陰離子交換柱，控制上樣液的線流速不高于lOOcm/h，柱子 預先用平衡緩沖液平衡；上柱過程中，收集流穿液，上柱結束后，用平衡緩沖液沖洗柱子，將 沖洗液并入流穿液中； (5) 超濾濃縮及調節(jié) 用截留分子量10K-30K的超濾膜濃縮步驟（4)得到的流穿液，然后用透析液恒體積透 析4-6倍，然后濃縮至蛋白濃度6-7%(w/v)左右，轉移出超濾膜包并用透析液后洗膜包，再 用透析液調蛋白濃度至5. 30-5. 50% (w/v); (6) 低PH解化 用0. 22微米的除菌濾忍過濾步驟（5)所述的蛋白溶液，后置于室溫解化21天； (7) 納米膜除病毒過濾 用20納米的濾忍過濾步驟（6)解化結束的蛋白溶液W去除病毒； (8) 除菌過濾并分裝。
[0013] 步驟（1)所述的投料比為1 :8-12,即一份重量的組分II+III沉淀投入到8-12份 重量的溶解緩沖液中；所述的懸浮緩沖液為10-30mmol/L的醋酸-醋酸鋼緩沖液；懸浮緩 沖液的PH值為4. 00-4. 80 ;懸浮緩沖液的溫度為0-5 °C。
[0014] 步驟（2)所述的萃取液組成為10-30mM醋酸鋼，20-60mM辛酸；萃取液的PH值為 5. 20-6. 00 ;萃取液的溫度為5~10°C;所述的萃取液重量是步驟（1)所得懸浮液總重的 0. 8-1. 2 倍。
[0015] 步驟（4)所述的陰離子交換柱所用填料為CaptoQ、CaptoDEAE、QSe地aroseFF 及DEAESe地aroseFF中的任意一種；所述的平衡緩沖液為10-20mmol/L的醋酸-醋酸鋼 溶液，平衡緩沖液的PH為5. 20-6. 00。
[0016] 步驟（5)所述的透析液為1-3% (w/w)甘氨酸水溶液；透析液的PH值為3. 95-4. 05; 透析液的溫度為2-8°C。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：（1)，制備工藝避免了乙醇的使用，降低了蛋白變性受損 的概率，產品更加穩(wěn)定，制品的多聚體、IgA、PKA及ACA均比傳統(tǒng)工藝大幅下降；（2)，采用含 辛酸的萃取液使組分ΙΙ+ΙΠ中的目標蛋白選擇性溶出，而其它雜蛋白則處于凝結狀態(tài)，一 步萃取即達到很高的IgG純度；（3)，采用辛酸萃取技術，省去了傳統(tǒng)工藝中乙醇反復沉淀 的步驟，大大縮短了生產周期，減輕了操作者的勞動強度；（4)，超濾透析操作中，蛋白溶 液與透析液中均添加蛋白保護劑，減少了超濾對蛋白的剪切損傷；（5)，采用辛酸萃取結合 陰離子交換柱層析技術完成對IgG的純化，流程短，工序少，能耗低，純度高，得率可達2200 瓶左右，遠局傳統(tǒng)工藝。
【附圖說明】
[001引附圖為從組分II+III中制備靜注人免疫球蛋白（PH4)的流程框圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合附圖與實施例對本發(fā)明作進一步的說明，實施例只是為了使本領域的技 術人員更好地理解本發(fā)明，不可理解為對本發(fā)明權力保護范圍的限定，相反，對于本領域的 普通科研人員而言，凡利用本發(fā)明進行的任何非實質性的改動或調整，均應落入本發(fā)明的 保護范圍之內。
[0020] 實施例一， 1，組分ΙΙ+ΙΠ沉淀的懸?。悍Q取組分ΙΙ+ΙΠ沉淀化g，投入8kg溶解緩沖液（20mmol/L的醋酸-醋酸鋼緩沖液，PH4. 10-4. 20, 0~rC)中，均勻攬拌3小時，使沉淀充分懸?。?2, 辛酸萃?。簩上懸浮液與9kg萃取液（20mmol/L醋酸鋼，40mmol/L辛酸， P冊.90-6. 00, 5~6°C)混合，攬拌5小時，使目標