乙型肝炎病毒八種基因分型的熒光pcr試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種乙型肝炎病毒八種基因分型的巧光 PCR試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型病毒性肝炎是長(zhǎng)期困擾全球醫(yī)學(xué)界的難題，是急慢性肝炎、肝硬化、肝癌的重 要致病因子之一，也是全世界最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)WT0報(bào)告，全球60多億人 口中，有大約30億人口生活在乙型肝炎病毒（皿V)高流行地區(qū)，超過20億人感染過皿V，其 中慢性感染者超過3.5億。我國(guó)每年的乙肝發(fā)病率在6 000萬人次W上，是一個(gè)乙型病 毒性肝炎發(fā)病大國(guó)。在中國(guó)、東南亞和非洲等國(guó)家和地區(qū)，有約50%的肝硬化和70 - 90% 的肝癌，是由慢性皿V感染引起，而感染了皿V變異體的皿V攜帶者有7 - 30%。
[000引 目前根據(jù)基因序列的核巧酸差異將皿V分為A~Η8種基因型別，按照全基因序 列核巧酸差異> 8%或其S基因序列核巧酸差異> 4%的差異度判定為不同型別，同一基因 型滿足序列差異《5. 6%。皿V基因型別存在較明顯的地域性分布特點(diǎn)，A型在歐洲和中部非 洲多見巧型、C型主要分布于亞洲；D型分布區(qū)域最廣，流行于地中海、中東等地區(qū)；E型W 非洲為主；G型僅見于美國(guó)和歐洲；F、Η型分布在美國(guó)。我國(guó)WB型和C型分布為主，為優(yōu) 勢(shì)型，且存在南北差異，北方WC型為優(yōu)勢(shì)型，南方WΒ型為優(yōu)勢(shì)型；D型多分布于如新疆、 西藏、寧夏等少數(shù)民族地區(qū)，偶有A、E、F型報(bào)道，尚未見G、H型。有研究表明，皿V存在不同 基因型別的混合感染。
[0004] 目前乙型肝炎病毒基因分型的檢測(cè)方法包括基因序列測(cè)定、聚合酶鏈反應(yīng)-限制 性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP)、基因型特異性多引物對(duì)PCR分型（即巢式PCR法）、特 異性線性探針檢測(cè)法（INNO-LiPA)INN〇-LiPA、PCR微板核酸分子雜交化ISA法、單克隆抗體 ELISA法W及基因忍片。但運(yùn)些方法或多或少存在一些缺陷：如基因測(cè)序分型方法結(jié)果準(zhǔn) 確可靠，但過程繁瑣、費(fèi)時(shí)、成本高、難W推廣，不適合大樣本的檢測(cè)，且缺乏敏感性，不能發(fā) 現(xiàn)同一個(gè)體中兩種或兩種W上的皿V基因型的混合感染。PCR-RFLP對(duì)于單個(gè)核巧酸位點(diǎn)的 多態(tài)性所導(dǎo)致的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)改變有礙內(nèi)切酶消化，酶切不完全會(huì)出現(xiàn)復(fù)雜的條 帶，酶切圖譜識(shí)別復(fù)雜，因而影響基因分型的可信度，且該法同樣不能發(fā)現(xiàn)幾種基因型的混 合感染。巢式PCR法方法需要合成多條引物，需經(jīng)兩輪PCR過程，較RFLP法歷時(shí)長(zhǎng)，污染機(jī) 會(huì)較大，且無法完全避免出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶而妨礙觀察分型結(jié)果。INNO-LiPA存在價(jià)格 昂貴、特異性稍低的不足。單克隆抗體ELISA法不能對(duì)血清皿sAg陰性的皿V感染進(jìn)行基 因分型，W及少數(shù)皿sAg無法分型?；蛉唐嬖诔杀据^高、假陽性率高、不同忍片的集成 度不足等缺點(diǎn)，PCR微板核酸分子雜交化ISA法適用于自動(dòng)化程度高較高的實(shí)驗(yàn)室。
[0005] 對(duì)于分子實(shí)驗(yàn)室中大量樣本的常規(guī)檢測(cè)，急需準(zhǔn)確度高、特異性好、價(jià)格經(jīng)濟(jì)、快 速的檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種乙型肝炎病毒八種基因分型的巧光PCR試 劑盒及檢測(cè)方法，通過設(shè)計(jì)合成特異性針對(duì)乙型肝炎病毒八種基因亞型的引物和探針，并 結(jié)合PCR檢測(cè)方法的技術(shù)方案，實(shí)現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確測(cè)定乙型肝炎病毒分型，測(cè)定成本降低。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：乙型肝炎病毒八種基因分型的巧光PCR試劑盒，其特 征在于，所述試劑盒中包括如下三.、至⑨中的至少一個(gè)PCR反應(yīng)液體系： ① 針對(duì)乙型肝炎病毒A型基因型的PCR反應(yīng)液體系，包括如下引物和探針 皿V-A-FACCTGGGTGGGTAATAATTTGGA 皿V-A-RGAAACCACAATAGTTGCCTGATCTT HBV-A-PAATTGACTACTAGATCCCTG ② 針對(duì)乙型肝炎病毒B型基因型的PCR反應(yīng)液體系，包括如下引物和探針 HBV-B-FCTCGTGGTGGACTTCTCTCAATT 皿V-B-RATCCAGCGATAACCAGGACAAAT皿V-B-PCAAATCTCCAGTCACTCAC ③ 針對(duì)乙型肝炎病毒C型基因型的PCR反應(yīng)液體系，包括如下引物和探針 皿V-C-FGAGCCAACTCAAACAATCCAGAT HBV-C-RGAATGCTCCCGCTCCTACCT HBV-C-PCCCCAACAAGGATC ④ 針對(duì)乙型肝炎病毒D型基因型的PCR反應(yīng)液體系，包括如下引物和探針 皿V-D-FGGGAACTTTACTGGGCTTTATTCTT 皿V-D-RGGGCCTACAAACTGTTCACATTT HBV-D-PCTCATTGGAAAACACC ⑥ 針對(duì)乙型肝炎病毒E型基因型的PCR反應(yīng)液體系，包括如下引物和探針 HBV-E-FAGTGAACCCTGTTCCGACTACTG HBV-E-RGGTCCCCAATCCTCGAGAA HBV-E-PCTCACTCATCTCGTCAAT ⑧ 針對(duì)乙型肝炎病毒F型基因型的PCR反應(yīng)液體系，包括如下引物和探針 HBV-F-FGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACC 皿V-F-RGTAATGATCCCCAACTGCCAAT 皿V-F-PATGGATACCCACAGATAA ⑦ 針對(duì)乙型肝炎病毒G型基因型的PCR反應(yīng)液體系，包括如下引物和探針 皿V-G-FTGGAAAGTCTGTCAACGAATAACTG 皿V-G-RAAGGCAGGGTAACCACATTGG HBV-G-PTTTCGCTGCTCCTTTT ⑨ 針對(duì)乙型肝炎病毒Η型基因型的PCR反應(yīng)液體系，包括如下引物和探針 HBV-H-FCCCGTGTGTCCTCTACTTCCA 皿V-H-RAAGAGTGGTGCAGGTTTTGCA皿V-H-PATCTACAACCACCAGCACG。
[0008] 優(yōu)選的，所述每種探針一端標(biāo)記有巧光報(bào)告基團(tuán)FAM、ΤΕΤ、肥X、R0X、JOE、CY3、 CY5、TAMRA或TexasRed,另一端標(biāo)記有巧光澤滅基團(tuán)MGB、B冊(cè)-1、B冊(cè)-2、LowaBlackRQ、 LowaBlack?FQ或D油巧 1。
[0009] 更優(yōu)選的，所述針對(duì)乙型肝炎病毒A-D型基因型的PCR反應(yīng)液體系組成第一反應(yīng) 體系，其中皿V-A-P的5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記MGB，皿V-B-P的5'端標(biāo)記肥X，3'端標(biāo)記 MGB，皿V-C-P的5'端標(biāo)記R0X，3'端標(biāo)記MGB，皿V-D-P的5'端標(biāo)記CY5, 3'端標(biāo)記MGB; 針對(duì)乙型肝炎病毒E-H型基因型的PCR反應(yīng)液體系組成第二反應(yīng)體系，其中皿V-E-P的5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記MGB，皿V-F-P的5'端標(biāo)記肥X，3'端標(biāo)記MGB，皿V-G-P的5' 端標(biāo)記R0X，3'端標(biāo)記MGB，皿V-H-P的5'端標(biāo)記CY5, 3'端標(biāo)記MGB。
[0010] 所述試劑盒中還包括乙型肝炎病毒A-H型基因型的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0011] 本發(fā)明還提供乙型肝炎病毒八種基因分型的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，所 述方法包括W下步驟： (1) 合成權(quán)利要求1所述的引物和探針； (2) 根據(jù)儀器對(duì)各探針兩端分別標(biāo)記權(quán)利要求2中所述的巧光報(bào)告基團(tuán)和相應(yīng)的巧光 澤滅基團(tuán)； (3)制備陽性標(biāo)準(zhǔn)品； (4) 提取待測(cè)樣品DNA; (5) 準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系； (6) 運(yùn)行PCR; (7) 數(shù)據(jù)分析。
[0012] 優(yōu)選的，所述步驟（3)中陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為構(gòu)建分別包含乙型肝炎病 毒A-H八種基因亞型檢測(cè)祀標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)序列的質(zhì)粒：分別合成乙型肝炎病毒A-H八種基 因亞型檢測(cè)祀標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)序列并克隆入P18-T載體中，命名為PMT-HBV-A，PMT-HBV-B， PMT-HBV-C，PMT-HBV-D，PMT-HBV-E，PMT-HBV-F，PMT-HBV-G，PMT-HBV-H。
[0013] 更優(yōu)選的，所述步驟（2)中探針的標(biāo)記分別為：皿V-A-P的5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo) 記MGB，皿V-B-P的5'端標(biāo)記肥X，3'端標(biāo)記MGB，皿V-C-P的5'端標(biāo)記R0X，3'端標(biāo)記MGB， 皿V-D-P的5'端標(biāo)記CY5,3'端標(biāo)記MGB;皿V-E-P的5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記MGB，皿V-F-P 的5'端標(biāo)記肥X，3'端標(biāo)記MGB，皿V-G-P的5'端標(biāo)記R0X，3'端標(biāo)記MGB，皿V-H-P的5' 端標(biāo)記CY5, 3'端標(biāo)記MGB; 步驟（5)中PCR反應(yīng)體系分成兩個(gè)，針對(duì)乙型肝炎病毒ABCD型基因型的引物和探針加 入至第一反應(yīng)體系，針對(duì)乙型肝炎病毒EFGH型基因型的引物和探針加入至第二反應(yīng)體系。
[0014] 優(yōu)選的，所述步驟（6)運(yùn)行PCR時(shí)巧光通道檢測(cè)選擇：檢測(cè)選用FAM、肥X、R0X和 CY5通道。
[0015] 所述步驟（6)運(yùn)行PCR是的反應(yīng)程序?yàn)?5°C2min;再按95°C15s，60°CImin，循 環(huán)40次。
[0016] 上述技術(shù)方案中，分別針對(duì)乙型肝炎病毒八種基因分型的引物和探針具有良好的 特異性，用于巧光PCR反應(yīng)，不存在互相干擾，每種探針一端標(biāo)記有巧光報(bào)告基團(tuán)，另一端 標(biāo)記有巧光澤滅基團(tuán)，不同種探針的巧光報(bào)告基團(tuán)不同，當(dāng)被檢測(cè)的樣本在某種分型的引 物引導(dǎo)下擴(kuò)增后，與相應(yīng)分型的探針結(jié)合，通過其探針的巧光報(bào)告基團(tuán)，則可檢測(cè)出樣本是 被哪種分型的乙型肝炎病毒感染，實(shí)際應(yīng)用中，鑒于儀器、巧光素選擇范圍等因素，可將針 對(duì)乙型肝炎病毒A-D型基因型的PCR反應(yīng)液體系組成第一反應(yīng)體系，針對(duì)乙型肝炎病毒E-H 型基因型的PCR反應(yīng)液體系組成第二反應(yīng)體系。
[0017] 為提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，試劑盒種配置了八種亞型的陽性標(biāo)準(zhǔn)品，該標(biāo)準(zhǔn)品可W是 各種亞型的全序列，（其序列全長(zhǎng)可在基因庫查)，也可W是包括檢測(cè)祀標(biāo)基因位點(diǎn)的一段 基因序列，上述序列委托公司合成即可，所述的檢測(cè)祀標(biāo)基因位點(diǎn)即本發(fā)明篩選的各亞型 的高度保守序列位點(diǎn)，應(yīng)用時(shí)，通過PC