表達(dá)可溶性人乳頭瘤病毒16亞型l1蛋白的重組質(zhì)粒及其表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種表達(dá)可溶性人乳頭瘤病毒16亞型Ll蛋白的重組質(zhì)粒、構(gòu)建方法、 重組工程菌及其表達(dá)方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭瘤病毒（HumanPapillomavirus,HPV)是一類雙鏈小分子DNA病毒，具有 嚴(yán)格的種屬特異性，主要感染人的皮膚和粘膜組織，引起相應(yīng)部位上皮組織的增生性病變。 1977 年Lave;rty(Lave;rty,C.R. ,Russell,P.etal. 1977)在電鏡中觀察到宮頸癌組織中存 在HPV顆粒，1981 年，ZurHausen(HZiirHausen,etal. 1981)提出HPV可能與宮頸癌發(fā)病 有關(guān)的假設(shè)。此后，運(yùn)一觀點(diǎn)被越來越多的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。宮頸癌發(fā)病與人乳頭瘤病毒化uman papillomavirusJPV)感染有直接關(guān)系，采用靈敏的檢測(cè)方法，可W從幾乎100%的宮頸癌 患者病變組織中檢測(cè)到高危HPV-DNA。
[0003] 根據(jù)核酸序列同源性，目前發(fā)現(xiàn)的HPV約有200多種基因型，其中與人類生殖道感 染有關(guān)的有40多種，依致病性不同，可分為高危型和低危型兩類，HPV感染者發(fā)展為子宮頸 癌的幾率約0. 2%。其中宮頸癌患者中，約50~60%是由HPV-16感染引起（^dboomers J.M.etal.，1999)，在世界范圍內(nèi)，HPV-16是與宮頸癌聯(lián)系最緊密的基因型，并隨地域變化 很小值oorbar，J. ,2005)。另外冊(cè)￥18、33、45、52和58與宮頸癌的發(fā)生高度相關(guān)。全球每 年有約50萬婦女患宮頸癌化OUtskyLA.etal.，1988)，其中約27萬因?qū)m頸癌死亡（80% W上在發(fā)展中國(guó)家），宮頸癌發(fā)病率僅次于乳腺癌。
[0004] 因此，開發(fā)一種價(jià)格適宜、保護(hù)性良好的宮頸癌疫苗，特別是針對(duì)HPV-16的疫苗， 對(duì)于降低婦女宮頸癌發(fā)病和死亡率意義重大。
[0005]HPV基因組長(zhǎng)約8化，分子量約為5XIO6道爾頓，直徑為50~60皿，正二十面體結(jié) 構(gòu)。核屯、為單拷貝的基因組DNA，病毒衣殼由主要衣殼蛋白化1)和次要衣殼蛋白化2)組 成。其中，Ll蛋白是較大的衣殼蛋白，分子量為55-60kDa，為主要衣殼蛋白，是高度保守的 糖蛋白，具有高度的免疫原性，也是HPV分型的依據(jù)，同時(shí)體外表達(dá)的HPVLl蛋白可自組裝 成病毒樣顆粒（virus-Ukeparticle,VLP) (Kirnbauer,R.etal. , 1992)。L2 蛋白為次要 衣殼蛋白是高度可變核蛋白，反映HPV抗原的多態(tài)性（Wang,J.W.，Roden,R.B.，2013)。而且 在病毒殼粒中大多數(shù)L2蛋白在Ll蛋白內(nèi)部，因此，在開發(fā)宮頸癌疫苗時(shí)，針對(duì)衣殼蛋白Ll 開發(fā)具有更好的針對(duì)性。
[0006] 根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果，Ll基因是一個(gè)好的免疫預(yù)防祀。在細(xì)菌中表達(dá)的Ll蛋白或 使用疫苗載體的Ll蛋白用于免疫，可保護(hù)動(dòng)物不受病毒感染。在酵母細(xì)胞及桿狀病毒表達(dá) 系統(tǒng)中表達(dá)HPVLl基因組裝成病毒樣顆粒（VLP)，該病毒樣顆粒已經(jīng)用于誘導(dǎo)與保護(hù)免受 病毒侵襲有關(guān)的高效價(jià)病毒中和抗體應(yīng)答。再者，VLP在形態(tài)學(xué)上與HPV毒粒完全相同，但 不含有潛在的病毒致癌基因，因此能誘導(dǎo)抗體應(yīng)答而無感染或致癌危險(xiǎn)性，在一定程度上， 能夠替代天然病毒，經(jīng)免疫后可誘導(dǎo)產(chǎn)生型別特異性中和抗體，有效保護(hù)機(jī)體免受同型病 毒的感染或再感染，因此VLP是HPV疫苗試驗(yàn)中最好的免疫原候選者之一。
[0007] 最早關(guān)于HPV衣殼蛋白裝配成VLP的研究是20世紀(jì)90年代用痘苗病毒表達(dá)系 統(tǒng)表達(dá)的HPV16Ll和L2蛋白狂houJ.et曰1.，1991)。Rose等用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成 功表達(dá)了HPVLl蛋白并自組裝成VLP(RoseR.C.et曰1.，1993)，專利W09420137(Rose R.C.etal.)公開了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備LI蛋白及VLP。化fmann在釀酒酵母中表達(dá)了 HPV6aLlW及L1+L2蛋白，并觀察到了自組裝成的VLPOtofmannK.J.etal.，1995)，專利 W09531532〇tofmannK.J.etal.)公開了由酵母表達(dá)系統(tǒng)制備重組VLP化LL1+L2)的方法。 專利US5888516(Kat虹inU.Jansen，etal.)也在釀酒酵母中表達(dá)了HPV16Ll和L1+L2 并觀察到了自組裝成的VLP。
[0008]目前，有多家國(guó)外公司的HPV疫苗進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，其中包括DNA疫苗W及治療 性宮頸癌疫苗。其中由葛蘭素史克（GlaxoSmithKline,GSK)公司開發(fā)的有HPV16、18病 毒衣殼蛋白Ll在昆蟲細(xì)胞中自行組裝成的二價(jià)VLPs疫苗（商品名CcrvarixK嫂苗）及默克 (Merck)公司開發(fā)的是HPV6、11、16、18病毒衣殼蛋白Ll在酵母菌中組裝而成的四價(jià)VLPs 疫苗（商品名化地1川8=^苗）均已在國(guó)外上市。2014年12月10日，F(xiàn)DA官網(wǎng)宣布：Merck 公司研發(fā)的Gardasi!" 9巧價(jià)重組HPV疫苗）獲批。
[0009] 但是目前尚無利用Sumo標(biāo)簽大腸桿菌系統(tǒng)中用于促進(jìn)HPV16Ll表達(dá)及用于制 備宮頸癌疫苗的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種表達(dá)可溶性人乳頭瘤病毒16亞型Ll蛋白 的重組質(zhì)粒、構(gòu)建方法、重組工程菌及其表達(dá)方法，W提高HPV16Ll蛋白的可溶性、活性及 表達(dá)量。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種表達(dá)可溶性人乳頭瘤病毒 16亞型Ll蛋白的重組質(zhì)粒，將人乳頭瘤病毒16亞型Ll基因和Sumo-tag標(biāo)簽基因插入表 達(dá)載體中構(gòu)建而成。
[0012] 所述重組質(zhì)粒中Sumo-tag標(biāo)簽基因3'末端與人乳頭瘤病毒16亞型Ll基因5' 末端連接。
[0013] 所述重組質(zhì)粒包括如SEQIDNO. 7所示的核巧酸序列。
[0014] 所述Sumo-tag標(biāo)簽基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0015] 所述人乳頭瘤病毒16亞型Ll基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 4所示。
[0016] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種表達(dá)可溶性人乳頭瘤病毒16亞型Ll蛋 白的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括W下步驟：
[0017] (1)將Sumo標(biāo)簽基因上游5'端引入限制性內(nèi)切酶化OI酶切位點(diǎn)和6*化s-tag 基因，在下游3'端引入限制性內(nèi)切酶BsaI酶切位點(diǎn)，得到Sumo-tag標(biāo)簽基因；
[0018] (2)將Sumo-tag標(biāo)簽基因和祀T-28a質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶化OI和BamHI 雙酶切，二者的酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒I;重組質(zhì)粒I轉(zhuǎn)化大 腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109,涂布在KanaYLB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取單克隆接種于KanaYLB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并進(jìn)行菌液PCR鑒定，篩選陽(yáng)性菌落，提取陽(yáng)性菌落質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè) 序結(jié)果正確的，命名為重組質(zhì)粒祀T28-Sumo ;
[0019] (3)設(shè)計(jì)合成人乳頭瘤病毒16亞型LI基因，裝入PUC57質(zhì)粒中，根據(jù)基因序列設(shè) 計(jì)合成正向引物H-F、反向引物H-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切核酸酶Bsa I和化OI雙酶切消化，備用；
[0020] (4)重組質(zhì)粒祀T28-Sumo用限制性內(nèi)切核酸酶BsaI和化OI雙酶切消化，備用；
[002。 妨將步驟做和（4)的雙酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒II; 重組質(zhì)粒II轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109,涂布在KanaYLB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取單 克隆接種于Kana7LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并進(jìn)行菌液PCR鑒定，篩選陽(yáng)性菌落，提取陽(yáng)性菌 落質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的，即為表達(dá)可溶性人乳頭瘤病毒16亞型Ll蛋白的重組質(zhì) 粒。
[002引所述正向引物H-F、反向引物H-R為：
[0023]H-F:5,-TTGGTCTCTAGGTATGTCTCTGTGGCTGCCG-3,；
[0024]H-R: 5' -AATCTCGAGTTACAGTTTACGTTTTTTACG-3，。
[00巧]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種包含表達(dá)可溶性人乳頭瘤病毒16亞型Ll蛋白的重組質(zhì)粒的重組工程菌，所述重組質(zhì)粒的宿主為大腸桿菌化21 0E3)。
[0026] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種所述重組工程菌誘導(dǎo)表達(dá)可溶性人乳 頭瘤病毒16亞型Ll蛋白的方法，包括W下步驟：
[0027] (1)將重組工程菌接種于Kana7LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0〇45。值為0. 8時(shí)，加入 IPTG，使其終濃度為0. 3mM，然后于20°C誘導(dǎo)表達(dá)IOh;
[0028] (2)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，離屯、收集菌體，清洗菌體，加入破菌緩沖液高壓破碎，離屯、， 收集上清液，純化即得。
[0029] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種誘導(dǎo)表達(dá)的可溶性人乳頭瘤病毒16亞 型Ll蛋白在制備HPV疫苗方面的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明有益效果
[0031] (1)本發(fā)明對(duì)HPV16Ll基因進(jìn)行優(yōu)化，使其更適合在大腸桿菌宿主中高效率表 達(dá)目標(biāo)蛋白，同時(shí)，本發(fā)明首次應(yīng)用Sumo標(biāo)簽表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中融合表達(dá)HPV16LI, Sumo標(biāo)簽具有分子伴侶功能，能促進(jìn)目的蛋白的正確折疊等特點(diǎn)，同時(shí)對(duì)熱和蛋白酶有很 強(qiáng)的抗性，有利于保持目的蛋白的穩(wěn)定性，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HPV16Ll基因僅WHis標(biāo)簽融合形 式在祀T28a載體中幾乎無目的蛋白表達(dá)，而本發(fā)明中與Sumo標(biāo)簽融合表達(dá)時(shí)，目的蛋白的 可溶性有明顯增加，如圖3所示，可溶性目的蛋白含量約占到總蛋白含量的50%，經(jīng)血凝實(shí) 驗(yàn)證實(shí)其血凝價(jià)明顯提高，說明表達(dá)的可溶性目的蛋白具有更高活性。
[0032] (2)本發(fā)明的方法顯著提高了目的蛋白可溶性表達(dá)的效率，且產(chǎn)品性質(zhì)均一、穩(wěn) 定，發(fā)酵破菌液上清中的目的蛋白表達(dá)量可達(dá)到70yg/ml，運(yùn)一數(shù)值明顯高于本發(fā)明目的 蛋白在其他原核表達(dá)系統(tǒng)中的產(chǎn)量，從而滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
[0033] (3)本發(fā)明在保證表達(dá)產(chǎn)物天然活性的前提下，經(jīng)過發(fā)酵純化，得到自組裝成穩(wěn)定 的病毒樣顆粒（VL巧的HPV16Ll蛋白。實(shí)驗(yàn)表明，純化的VLP能使小鼠產(chǎn)生較高滴度的抗 體，并通過血凝抑制試驗(yàn)化I)和假病毒中和實(shí)驗(yàn)證明其具備中和活性。W上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說 明，通過大腸桿菌病毒樣顆粒技術(shù)平臺(tái)制備的HPVl化1VLP能用于生產(chǎn)預(yù)防宮頸癌的疫苗。
[0034] (4)本發(fā)明提供了一種原核表達(dá)可