用于前列腺細胞培養(yǎng)的前列腺細胞外基質凝膠的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)領域，特別涉及一種用于前列腺細胞培養(yǎng)的前列腺細胞外基質凝膠。
【背景技術】
[0002]細胞培養(yǎng)技術也叫細胞克隆技術，是生物技術領域最核心、最基礎的技術。細胞培養(yǎng)的一般過程包括1)準備工作:器皿的清洗、干燥、消毒、培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌、無菌室或超凈臺的清潔與消毒、培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調試等；2)取材:無菌環(huán)境下從機體取出組織細胞，處理后接入培養(yǎng)器皿中；3)培養(yǎng):將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。培養(yǎng)中的細胞應每隔一段時間觀察一次，觀察的內容包括細胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的pH是否太酸或太堿，此外對培養(yǎng)溫度和C02濃度也要定期檢查；4)凍存及復蘇。在生命科學基礎領域，對于細胞的培養(yǎng)，人們關注的不僅僅是它們的分裂生長，更為重要的是它們經(jīng)過傳代后能否維持體內的形狀。
[0003]由于細胞是在體外改變的環(huán)境下增生，所以利用現(xiàn)有技術培養(yǎng)細胞，細胞喪失了原有的性狀。利用現(xiàn)有技術培養(yǎng)細胞，細胞呈平面生長模式，細胞在培養(yǎng)基表面生長，并且只會沿著培養(yǎng)基的平面延伸，這與哺乳動物機體內細胞生長生理狀態(tài)不相符合，難以模擬細胞在哺乳動物機體內的自然生長環(huán)境，這就與人們進行細胞培養(yǎng)的初衷相違背了。且細胞進入增殖期較快，增殖期較短，一周內達到高峰，然后進入平臺期。

【發(fā)明內容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于前列腺細胞培養(yǎng)的前列腺細胞外基質凝膠。該前列腺細胞外基質凝膠呈白色半透明狀，具有良好的生物相容性；利用該前列腺細胞外基質凝膠培養(yǎng)人體前列腺上皮細胞，細胞呈簇狀三維立體空間生長模式，這與哺乳動物機體內細胞生長生理狀態(tài)相一致，能夠更好地模擬細胞在哺乳動物機體內的自然生長環(huán)境。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下:
[0006]用于前列腺細胞培養(yǎng)的前列腺細胞外基質凝膠，其制備方法包括以下步驟:
[0007]A.前列腺細胞外基質的制備:無菌條件下取雄性成年哺乳動物膀胱組織切片，切片的規(guī)格為lcmX lcmX0.5cm ;取切片10片，加入5_15mL濃度為9-llkIU/mL的抑肽酶溶液，于4°C條件下攪拌45-55h ;接著在5-10mL質量分數(shù)為0.85-1.2%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液中于4°C條件下攪拌20-30h ;然后在5-10mL質量分數(shù)為0.75-1.5%的十二烷基硫酸鈉溶液中于4°C條件下攪拌20-30h ;再在5-15mL DNA水解酶的濃度為45_55U/mL、RNA酶A的濃度為0.5-1.5U/mL的溶液中在4°C條件下攪拌20_28h ;用1XPBS緩沖液清洗三次，每次5min，冷藏、凍干并通過10_15kGy Co6°福照殺菌，并置于_20°C條件下存放；
[0008]B.前列腺細胞外基質凝膠的制備:將步驟A所得樣品于-80°C冷凍，然后用冷凍研磨機研磨45-60h成為粉末，取lg研磨后粉末和lOOmg胃蛋白酶混合在100mL的0.0lmol/L鹽酸溶液中，室溫攪拌40-55h，將混合物在4°C條件下移至離心管中，在轉速3000r/min條件下離心15min ;收集上清液，過濾，取過濾后溶液置于_80°C條件下儲存直至進一步使用；再在4°C條件下加入15mL 10 X PBS緩沖液，用0.01nmol/L NaOH溶液將過濾后溶液的pH值調至7.4，置于37°C條件下孵育30min得到前列腺細胞外基質凝膠。
[0009]所述細胞外基質(ECM)是動物細胞合成并分泌到細胞外、分布在細胞表面或細胞之間的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白聚糖。這些物質構成復雜的網(wǎng)架結構，支持并連接組織結構、調節(jié)細胞的生理活動。所述凝膠是組織工程材料的重要組成部分，具有網(wǎng)狀多空的空間結構，能保持一定的形狀，性質柔軟，富含水分，利于細胞生長所需的氧氣和營養(yǎng)物質的傳遞和運輸。目前尚未有利用哺乳動物前列腺組織制備凝膠來進行細胞培養(yǎng)的相關報道，這是本發(fā)明的一個創(chuàng)新點所在。且由于前列腺組織來自生物機體內，以前列腺組織制備的凝膠來進行細胞培養(yǎng)，更貼近體內環(huán)境，能夠更好的模擬細胞在體內的自然生長環(huán)環(huán)境。
[0010]進一步，步驟A中所述抑肽酶溶液的濃度為10kIU/mL，體積為8mL，在該溶液中的攪拌時間為48h。所述抑肽酶別名抑胰肽酶、屈來密多、胰蛋白酶抑制劑，是一種非特異性血清蛋白酶抑制劑，具有保護血小板、抑制纖溶蛋白的作用。抑肽酶是細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的保護劑，在中性和酸性環(huán)境下穩(wěn)定，耐高溫，耐蛋白水解酶降解。它對一些絲氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)有抑制能力。
[0011]進一步，步驟A中所述聚乙二醇辛基苯基醚溶液的質量分數(shù)為1 %，體積為5mL，在該溶液中的攪拌時間為24h。
[0012]進一步，步驟A中所述十二烷基硫酸鈉溶液的質量分數(shù)為1 %，體積為7.5mL，在該溶液中的攪拌時間為24h。所述十二烷基硫酸鈉為一種無毒的陰離子表面活性劑，具有良好的乳化、發(fā)泡、滲透、去污和分散性能。
[0013]進一步，所述DNA水解酶和RNA酶A的濃度分別為50U/mL和lU/mL，該含有DNA水解酶和RNA酶A的溶液的體積為10mL，在該溶液中的攪拌時間為24h。所述DNA水解酶用于切斷磷酸二酯鍵的酶，這些酶使糖-磷酸酯主鏈上的磷酸二酯鍵水解。所述RNA酶A是一類催化RNA降解的核酸酶。
[0014]進一步，步驟A中所述Co6°輻照殺菌的強度為12kGy。所述輻照殺菌耗能低，與傳統(tǒng)的方法相比，可節(jié)省能源幾倍到十幾倍；射線穿透力強，可殺滅各種包裝、散裝、固體、液體表面及內部的各種微生物和害蟲；輻照加工屬于冷加工，不會引起內部溫度的明顯增加，同時它又是物理加工，不需要添加任何化學藥劑，沒有農藥殘留，也不發(fā)生放射性，不污染環(huán)境。
[0015]進一步，步驟B中所述過濾步驟所用過濾器為0.2mm的針頭式過濾器。所述枕頭式過濾器外殼材料選用優(yōu)質衛(wèi)生級聚丙烯材料，產(chǎn)品結構設計精密，保證了過濾的流暢，內部空間合理化，殘留率非常低，從而減少了樣品的浪費。
[0016]本發(fā)明的目的之二在于保護所述前列腺細胞外基質凝膠的使用方法，該使用方法包括以下步驟:將1 X 104個前列腺細胞與100 μ L前列腺細胞外基質凝膠混合均勻，加入24孔板孵育30min，然后加入培養(yǎng)基，在C02體積分數(shù)為5 %、空氣體積分數(shù)為95 %的氣體環(huán)境進行培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)基1次。所述前列腺細胞的個數(shù)通過計數(shù)實現(xiàn)。
[0017]進一步，所述培養(yǎng)基為角質形成細胞無血清培養(yǎng)基。所述角質形成細胞無血清培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基的一種。無血清培養(yǎng)基是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。一般由基礎培養(yǎng)基和替代血清的補充因子組成。無血清培養(yǎng)基中未添加血清，但含有個別蛋白或大量蛋白組分。無血清培養(yǎng)基具有以下優(yōu)勢:1)未知組分少；2)培養(yǎng)基中不存在血清中的抗體、補體等成分，對培養(yǎng)細胞影響?。?)雜蛋白含量少，生產(chǎn)的產(chǎn)品后期處理較容易；4)無血清培養(yǎng)可以實現(xiàn)細胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，增加培養(yǎng)液的利用率。
[0018]本發(fā)明的目的還在于提供所述前列腺細胞外基質凝膠在人體前列腺上皮組細胞培養(yǎng)中的應用。
[0019]本發(fā)明的有益技術效果是:
[0020]本發(fā)明的前列腺細胞外基質凝膠呈白色半透明狀，具有良好的生物相容性；利用該前列腺細胞外基質凝膠培養(yǎng)人體前列腺上皮細胞，細胞呈簇狀三維立體空間生長模式，這與哺乳動物機體內細胞生長生理狀態(tài)相一致，能夠更好地模擬細胞在哺乳動物機體內的自然生長環(huán)境；且增殖期較長(11天)，比利用現(xiàn)有技術所培養(yǎng)的細胞增殖期延長了 6天。
【附圖說明】
[0021]圖1A為實施例3得到的前列腺細胞外基質的蘇木精-伊紅染色結果顯示圖；
[0022]圖1B為實施例3得到的前列腺細胞基質的掃描電鏡結構；
[0023]圖1C為實施例3制備的前列腺細胞外基質凝膠；
[0024]圖2A為實施例4對照組所培養(yǎng)的細胞(培養(yǎng)5天)生長狀態(tài)；
[0025]圖2B為實施例4實驗組所培養(yǎng)的細胞(培養(yǎng)5天)生長狀態(tài)；
[0026]圖3中2D為實施例4對照組所培養(yǎng)的細胞生長曲線，圖3中3D為實施例4實驗組所培養(yǎng)的細胞生長曲線。
【具體實施方式】
[0027]為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本發(fā)明的實施例進行詳細的描述。
[0028]實施例1
[0029]用于前列腺細胞培養(yǎng)的前列腺細胞外基質凝膠，該前列腺細胞外基質凝膠的制備方法包括以下步驟:
[0030]A.前列腺細胞外基質的制備:無菌條件下取雄性成年哺乳動物膀胱組織切片，切片的規(guī)格為lcmXlcmX0.5cm ;取切片10片，加入5mL濃度為llkIU/mL的抑肽酶溶液，于4°C條件下攪拌55h ;接著在5mL質量分數(shù)為1.2%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液中于4°C條件下攪拌20h ;然后在10mL質量分數(shù)為0.75%的十二烷基硫酸鈉溶液中于4°C條件下攪拌30h ;再在5mL DNA水解酶的濃度為45U/mL、RNA酶A的濃度為1.5U/mL的溶液中在4°C條件下攪拌20h ;用1XPBS緩沖液清洗三次，每次5min，4°C條件下冷藏，再在真空條件下冷凍干燥并通過10-15kGy Co6°輻照殺菌，并置于_20°C條件下存放；所述真空條件下冷凍干燥的溫度為_10°C，真空度為12Pa ;
[0031]B.前列腺細胞外基質凝膠的制備:將步驟A所得樣品于_80°C冷凍，然后用冷凍研磨機研磨45h成為粉末，取lg研磨后粉末和lOOmg胃蛋白酶混合在lOOmL的0.01mol/L鹽酸溶液中，室溫攪拌55h，將混合物在4°C條件下移至離心管中，在轉速3000r/min條件下離心15min ;收集上清液，過濾，取過濾后溶液置于-80°C條件下儲存直至進一步使用；再在4°C條件下加入15mL 10\