一種臨床級胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了臨床級胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞 的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell, MSC)是一類組織來源廣泛，包括骨 髓、脂肪組織、乳牙組織、外周血等及新生兒臍帶血、臍帶、胎盤組織等具有多向分化潛能及 很強(qiáng)自我更新能力的成體組織干細(xì)胞，在體內(nèi)外可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、 肌細(xì)胞、肌腱細(xì)胞及肝細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分泌多能細(xì)胞因子及改善微環(huán)境及較低的免 疫原性；基于以上特點(diǎn)，使其在發(fā)現(xiàn)后迅速成為在細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)嵱眯?種子細(xì) 胞"。
[0003] 胎盤組織來源干細(xì)胞具有典型的間充質(zhì)干細(xì)胞特性，包括良好的自我更新、多向 分化潛能、免疫原性低等特點(diǎn)；并且組織取材方便、無創(chuàng)、無倫理限制且利用率高，是臨床級 間充質(zhì)干細(xì)胞良好的組織來源類型。
[0004] 目前胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法主要包括：灌流法、組織貼壁法和酶消化法。
[0005] 灌流法需要多次大量沖洗，工藝繁瑣、試劑消耗多且不易沖洗徹底，易造成污染等 弊端難以在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。
[0006] 組織貼壁法由于原代細(xì)胞擴(kuò)繁周期較長，短期內(nèi)難以獲得大量的細(xì)胞數(shù)量。
[0007] 酶消化法則包括單一酶類或組合酶類順序消化等方式。然而，酶消化法酶類選擇 眾多，消化步驟繁瑣、并且酶消化對于細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞活性影響較大。此外，消化后組 織一般要經(jīng)過濾網(wǎng)過濾后，才能獲得單細(xì)胞懸液，并且大量的紅細(xì)胞參雜其中，一定程度上 影響了細(xì)胞貼壁生長及增長了原代培養(yǎng)的周期。
[0008] 此外，對于胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增環(huán)節(jié)，目前多數(shù)還是使用含低濃度人源 或其他動(dòng)物源血清培養(yǎng)體系，血清成分的復(fù)雜與不明確性限制其用于臨床級細(xì)胞擴(kuò)增培 養(yǎng)。
[0009] 也有人嘗試在細(xì)胞傳代擴(kuò)增階段添加 bFGF等多種細(xì)胞因子替換血清成分，并將 細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行各種基質(zhì)蛋白膠體，如Matrigel、明膠等特殊包被處理，進(jìn)行無血清擴(kuò)增培 養(yǎng)，細(xì)胞雖然能夠生長，但細(xì)胞狀態(tài)不均一、操作復(fù)雜、包被環(huán)節(jié)成本較高、培養(yǎng)擴(kuò)增效果批 次穩(wěn)定性難以控制，并不適合于大規(guī)模的制備生產(chǎn)。
[0010] 綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞高效、低成本且易于通量 程序化操作的分離方法，以便于細(xì)胞產(chǎn)業(yè)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種對于人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的高效、簡便且易于高 通量產(chǎn)業(yè)化制備的臨床級胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法。
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種用所述方法制備的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，所得的胎 盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的細(xì)胞增殖能力、純度分析達(dá)國際標(biāo)準(zhǔn)并具有良好的成骨、成脂 和軟骨分化潛能，且在多次傳代后，仍能保持正常的核型。
[0013] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種臨床級胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，所述方 法包括步驟：
[0014] (a)對獲得的含間充質(zhì)干細(xì)胞的胎盤組織材料，進(jìn)行剪碎處理，從而經(jīng)剪碎的胎盤 組織材料；
[0015] (b)對上一步驟獲得的經(jīng)剪碎的胎盤組織材料，用組合消化酶進(jìn)行消化，從而獲得 經(jīng)消化的組織混合物，其中所述的組合消化酶包括膠原酶IV和胰蛋白酶；
[0016] (c)從所述經(jīng)消化的組織混合物中，取上清懸浮液；
[0017] (d)對上一步驟的所述上清懸浮液進(jìn)行離心，獲得沉淀；
[0018] (e)對上一步驟的所述沉淀，加入紅細(xì)胞裂解液，從而獲得經(jīng)紅細(xì)胞裂解處理的混 合物；
[0019] (f)對上一步驟的所述經(jīng)紅細(xì)胞裂解處理的混合物，進(jìn)行離心，獲得沉淀，即為原 代間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0020] (g)對上一步驟的所述原代間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行無血清擴(kuò)增傳代，從而經(jīng)傳代的臨 床級胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的胎盤組織材料經(jīng)病毒檢測為陰性。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的病毒檢測包括（但不限于）檢測以下一種或多種傳染性 病毒：乙肝病毒、丙肝病毒、HIV病毒、梅毒、巨細(xì)胞病毒等。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（a)，經(jīng)剪碎的胎盤組織材料，其體積大小為0.2_2ml，一 般0. 5ml左右（一般可置于例如15ml的離心管中）。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（b)中，所述的消化酶包括終濃度（工作濃度）為50U/ ml-100U/ml膠原酶IV和0· 005wt % -0· Olwt %胰蛋白酶；較佳地80U/ml膠原酶IV和 0. 008wt %。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（b)中，所述消化酶以含膠原酶IV和胰蛋白酶的組合消 化酶液的方式加入含所述的經(jīng)剪碎的胎盤組織材料的容器中（例如15ml離心管）。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（b)中，消化條件包括：在37±2°C下進(jìn)行消化；消化 6-24小時(shí)，較佳地消化8-20小時(shí)，更佳地消化12-18小時(shí)，優(yōu)選16h。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（b)中，膠原酶IV和胰蛋白酶可依次、先后、或同時(shí)加入； 優(yōu)選地，同時(shí)加入。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的胎盤組織材料包括胎盤羊膜組織、胎盤絨毛膜組織或其 組合。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（c)中包括：對所述經(jīng)消化的組織混合物進(jìn)行靜置處理 (約30秒-3分鐘，優(yōu)選45秒），然后取上清懸浮液。
[0030] 在步驟（d)中，所述的離心的條件為300_500g，離心時(shí)間為1-10分鐘。
[0031] 在步驟（e)中，所述的紅細(xì)胞裂解處理的條件為37±2°C，處理1-10分鐘。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（e)中，在紅細(xì)胞裂解處理后，加入l-10ml 1 %青霉素/ 鏈霉素 PBS液，進(jìn)行混勻后，從而獲得經(jīng)紅細(xì)胞裂解處理的混合物。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（f)中，所述的離心的條件為300_500g，離心時(shí)間為1-10 分鐘。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（g)中，所述傳代的次數(shù)為1-10次，較佳地1-5次。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（g)中，所述的傳代在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的無血清培養(yǎng)基包括Corning? stemgro? hMSC培養(yǎng)基， 無動(dòng)物異源成分、化學(xué)成分明確、批次穩(wěn)定的培養(yǎng)基，或其它無血清培養(yǎng)基。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的臨床級胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞制備符合以下標(biāo)準(zhǔn)：
[0038] (i)使用無血清、無異源動(dòng)物成分及化學(xué)成分明確的細(xì)胞培養(yǎng)傳代體系；
[0039] (ii)細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD73、CD90、CD105>95% 以上，CD34、CD45〈2% ;
[0040] (iii)具有成骨、成脂和軟骨分化潛能；和
[0041] (iv)體外多次傳代操作后，具有正常的人核型。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（g)中，在傳代培養(yǎng)時(shí)當(dāng)間充質(zhì)干細(xì)胞生長到80-90 %融 合度時(shí)，去除培養(yǎng)液，對所述間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行清洗，然后加入胰蛋白酶對所述間充質(zhì)干細(xì) 胞進(jìn)行處理，從而獲得經(jīng)胰蛋白酶消化處理的間充質(zhì)干細(xì)胞，用于后續(xù)傳代培養(yǎng)。
[0043] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的臨床級胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞群，所述的干 細(xì)胞群是用本發(fā)明第一方面所述方法制備的。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞群為1-3代的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞群具有以下特征：
[0046] (a)彡95% (較佳地彡97% )的細(xì)胞具有表面抗原CD73 ;
[0047] (b)彡95% (較佳地彡97% )的細(xì)胞具有表面抗原CD90 ;和
[0048] (c)彡95% (較佳地彡97% )的細(xì)胞具有表面抗原CD105。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞為人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述的干細(xì)胞群還具有以下特征：
[0051] (d)彡2% (較佳地彡1% )細(xì)胞具有表面抗原CD34 ;
[0052] (e)彡2% (較佳地彡1% )細(xì)胞具有表面抗原⑶45。
[0053] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于制備臨床級胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的工作液， 所述的工作液含有組合酶，所述組合酶包括膠原酶IV型和胰蛋白酶，并且
[0054] 所述的膠原酶IV型和胰蛋白酶的工作濃度分別為50-100u/ml和 0. 005-0.0 lwt%。
[0055] 在另一優(yōu)選例中，膠原酶IV型和胰蛋白酶的工作濃度分別為60-90u/ml (如80U/ ml)和 0· 006-0. 009wt% (如 0· 008wt% )。
[0056] 在另一優(yōu)選例中，所述的工作液所含的酶由膠原酶IV型和胰蛋白酶構(gòu)成。
[0057] 在另一優(yōu)選例中，所述的工作液由體積比為1 一 2:2-1的膠原酶IV型消化液和胰 蛋白酶消化液混合而成。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，所述膠原酶IV型和胰蛋白酶的含量之比為：50-100U膠原酶IV 型：5-10mg的胰蛋白酶。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述的工作液以2-4g: