骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng) 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymai stem cells，MSCs)，是在骨髓中的一種類似成 纖維細(xì)胞的一類細(xì)胞，具有多方向分化潛能，可以向骨組織、軟骨組織、皮膚、造血干細(xì)胞支 持介質(zhì)、骨骼肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞還具有取材方便、無免疫原 性、具有多向分化潛能、合乎倫理學(xué)要求并且無致瘤性，具有其它干細(xì)胞不可比擬的優(yōu)勢， 因此，探討MSCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)具有深遠(yuǎn)意義。
[0003]目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)多采用二維培養(yǎng)方式進(jìn)行的，但二維培養(yǎng)無法 滿足骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維環(huán)境，且由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強的貼壁 性，因此，在二維培養(yǎng)體系中，細(xì)胞易聚集成團(tuán)，細(xì)胞與培養(yǎng)基及誘導(dǎo)液的接觸面積較少，不 利于細(xì)胞的生長，從而造成細(xì)胞活性較差，誘導(dǎo)率低等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)中采用二維誘導(dǎo)培養(yǎng)體系誘導(dǎo)骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞存在細(xì)胞活性差，誘導(dǎo)率低等缺陷，提供一種能夠提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘 導(dǎo)率及細(xì)胞活性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維 誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0006] 獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用生物衍生骨進(jìn)行體外培養(yǎng)；
[0007] 在體外培養(yǎng)過程中，用誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)反應(yīng)。
[0008] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中，獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞的步驟包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分離液中離心，取中層單核細(xì)胞，PBS緩沖 液離心洗滌，棄上清液。
[0009] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中，所述生物衍生骨的制 備過程包括以下步驟：取骨塊于H202中浸泡36~80小時，每24小時換液一次；再浸泡于 雙蒸水中20~60分鐘后，依次于乙醇和丙酮中分別浸泡12~36小時后，再于雙蒸水中浸 泡20~60分鐘后，干燥冷凍，并滅菌。
[0010] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中，進(jìn)行體外培養(yǎng)之前， 還包括對所述生物衍生骨預(yù)處理的過程，包括以下步驟：將所述生物衍生骨浸泡于PBS溶 液中1-3天，去除骨渣，然后浸泡于無血清培養(yǎng)基中2-4天，再加入FBS浸潤1-5小時，獲得 浸潤后的生物衍生骨。
[0011] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中，所述體外培養(yǎng)過程包 括以下步驟：
[0012] 將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于浸潤后的生物衍生骨，靜置4-6小時后，加入完全培 養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得擴(kuò)增后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0013] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中，所述完全培養(yǎng)基中 添加有80-120U/ml的青霉素、80-120mg/ml的鏈霉素、0. 15-0. 50mg/ml的谷氨酞胺以及 l-5mg/ml 的 HEPES 緩沖液。
[0014] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中，用所述誘導(dǎo)液進(jìn)行誘 導(dǎo)反應(yīng)的過程步驟為：
[0015] 用所述誘導(dǎo)液對擴(kuò)增后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)7-10天，每2-4天換液 一次。
[0016] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中，所述誘導(dǎo)液包括 10 7-10 9mol/L的地塞米松、25-75 μ g/ml的維生素 C和5-15mmol/L的β -甘油磷酸鈉。
[0017] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中，所述體外培養(yǎng)過程是 在氧氣體積百分比為〇. 5%~6%的環(huán)境中進(jìn)行的。
[0018] 實施本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，可以達(dá)到以下有益效 果：通過采用經(jīng)處理后的生物衍生骨作為三維培養(yǎng)支架，不僅能夠維持模擬骨髓微環(huán)境的 三維多孔結(jié)構(gòu)，提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的吸附能力及生長增殖能力等，而且利用生物衍生 骨良好的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，從而提高了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率及細(xì)胞活性， 解決了現(xiàn)有技術(shù)中，采用二維培養(yǎng)體系誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在的細(xì)胞活性差，骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率低等問題。
【具體實施方式】
[0019] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中采用二維體系誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在細(xì)胞活性差，誘 導(dǎo)率低等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點在于提供一種三維培養(yǎng)體系以模擬骨髓微環(huán)境進(jìn)行誘導(dǎo)培 養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，避免了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在二維培養(yǎng)體系中易聚集成團(tuán)，與 培養(yǎng)基及誘導(dǎo)液接觸面積較少，不利于誘導(dǎo)培養(yǎng)的問題，從而可提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的 細(xì)胞活性，并提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率。
[0020] 具體地，本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0021] S1、獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0022] S2、制備生物衍生骨；
[0023] S3、預(yù)處理生物衍生骨，獲得浸潤后的生物衍生骨；
[0024] S4、將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于浸潤后的生物衍生骨內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)后，再用誘 導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)反應(yīng)。
[0025] 進(jìn)一步地，步驟S1 :獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的具體過程為：
[0026] 采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分離液中離心，取中層單核細(xì)胞，加入PBS緩沖 液，離心洗滌，棄上清液，即收獲原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0027] 可以理解的是，上述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取方式僅為本發(fā)明提供的其中一種， 本領(lǐng)域技術(shù)人員采用其他方式獲取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞同樣適用于本發(fā)明；另外，也可利 用現(xiàn)有技術(shù)中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化方法對步驟S1獲取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作進(jìn) 一步純化。
[0028] 步驟S2 :生物衍生骨的制備具體包括以下步驟：
[0029] 取lcmXO. 5cmX0. 5cm骨塊于H202溶液中浸泡36~80小時，每隔一段時間換液 一次，對骨塊進(jìn)行殺菌脫蛋白；再浸泡于雙蒸水中20~60分鐘后，依次于乙醇和丙酮中分 別浸泡12~36小時，去除骨組織中殘留的蛋白，再于雙蒸水中浸泡20~60分鐘后，干燥 冷凍，并滅菌，即獲得生物衍生骨，密封保存。
[0030] 經(jīng)過上述物理、化學(xué)處理后獲得的生物衍生骨，去掉了骨塊中的細(xì)胞成分及抗原 性，基本保持了原來生物體內(nèi)的孔隙網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞粘附、生長并為細(xì)胞外基質(zhì)分泌 提供充分的空間及表面積，同時還具有良好的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，有利于促進(jìn)骨髓間充 質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成成骨細(xì)胞。
[0031] 步驟S3 :預(yù)處理生物衍生骨，以增強生物衍生骨表面的細(xì)胞親和性，有利于細(xì)胞 貼附，并使培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子和營養(yǎng)因子部分融入到生物衍生骨內(nèi)，有利于骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞的生長，具體過程為：
[0032] 將S2中獲得的生物衍生骨浸泡于PBS溶液中1-3天，去除骨渣，然后浸泡于無血 清培養(yǎng)基2-4天，再加入FBS (胎牛血清）浸潤1-5小時，獲得浸潤后的生物衍生骨，以使生 物衍生骨中融有無血清培養(yǎng)基及FBS，更有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁生長。
[0033] 步驟S4 :將步驟S1獲取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于步驟S3中預(yù)處理的生物衍生 骨上并進(jìn)行多次擴(kuò)增培養(yǎng)后，加入誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0034] 需要說明的是由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞主要定居于骨髓的干細(xì)胞龕內(nèi)，而氧氣體積 百分比在干細(xì)胞龕內(nèi)血供較差的部位僅為1 %，而在血竇附近的則有6 %，因此，本發(fā)明步 驟S4全程是在氧氣體積百分比為0. 5%~6%的環(huán)境中進(jìn)行的，以模擬骨髓微環(huán)境，從而更 有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長和增殖，該步驟具體過程為：
[0035] S41、將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與步驟S3中獲得的浸潤后的生物衍生骨混合，靜置4-6 小時后，待骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與生物衍生骨充分貼附后加入完全培養(yǎng)基于體積百分比為 0. 5%~6% 02條件下進(jìn)行第一次擴(kuò)增培養(yǎng)，2-4天后，將生物衍生骨轉(zhuǎn)移至新的孔板中，以 剔除死細(xì)胞，添加完全培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行第二次擴(kuò)增培養(yǎng)；當(dāng)然也可根據(jù)實際情況進(jìn)行三次 以上擴(kuò)增培養(yǎng)，以獲取足夠量的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0036] 其中，完全培養(yǎng)基為含有10% FBS、0. 15-0. 50mg/ml谷氨酞胺、80-120U/ml青霉 素、80-120mg/ml 鏈霉素和 l-5mg/ml 的 HEPES 的 L-DMEM 培養(yǎng)基。
[0037] 其中，胎牛血清中含有豐富的細(xì)胞生長所必須的營養(yǎng)成份，能夠提供對維持細(xì)胞 指數(shù)生長的激素、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物、以及主要的低分子營養(yǎng)物，是細(xì)胞 貼壁、鋪展在培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來源；并且能夠提供蛋白酶抑制劑，使在細(xì)胞傳代時使剩 余胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受傷害。
[0038] 谷氨酞胺是細(xì)胞生長的必須氨基酸，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提供重要的能量來源； 脫掉氨基后，谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝，促進(jìn)細(xì) 胞分裂，因此能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長和增殖。
[0039] HEPES能夠防止培養(yǎng)基pH迅速變動，并維持培養(yǎng)基的pH值在7. 0左右。
[0040] 青霉素能夠阻礙細(xì)菌的細(xì)胞壁合成，導(dǎo)致細(xì)胞泄漏死亡，從而抑制細(xì)菌的生長；鏈 霉素能夠作用于細(xì)菌的核糖體，阻礙蛋白翻譯，從而抑制細(xì)菌生長；自然環(huán)境下，不考慮人 為產(chǎn)生的抗藥性，對青霉素不敏感的絕大多數(shù)微生物對鏈霉素敏感，反之亦然；因此，最為 優(yōu)選地是將青霉素和鏈霉素搭配使用能夠控制幾乎全部常見的細(xì)菌，從而能夠盡量避免細(xì) 菌對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長及活性造成的不良影響。因此，采用該血清培養(yǎng)基培養(yǎng)間充 質(zhì)干細(xì)胞不僅可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長和增殖，而且可避免培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的細(xì)菌 對細(xì)胞活性造成的影響。
[0041] 因此，本發(fā)明中采用該完全培養(yǎng)基結(jié)合生物衍生骨三維孔隙結(jié)構(gòu)，不僅能夠保證 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在擴(kuò)增階段能夠保持細(xì)胞活性，而且能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分 裂，促進(jìn)細(xì)胞生長增殖，以獲取更多的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0042] S42、待骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞第二次擴(kuò)增培養(yǎng)2-4天后，再加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基于氧 氣體積百分比為〇. 5%~6%的環(huán)境中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)7-10天，每2-4天半量換液一次；
[0043] 其中，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為包含有10% FBS和誘導(dǎo)液的L-DMEM培養(yǎng)基，誘導(dǎo)液包括 10