微生物檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物檢測方法，更詳細而言，涉及可降低被測試樣中所含的抗菌性 物質(zhì)的影響、高精度地檢測對象微生物的微生物檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在食品、醫(yī)藥品等領(lǐng)域中，為了確保質(zhì)量、安全性，進行產(chǎn)品、原料的微生物檢查。 對于其試驗方法，各領(lǐng)域中規(guī)定了官方方法，對于醫(yī)藥品，日本藥典中收載了各種微生物試 驗方法。其中，對于非無菌制劑及其原料，規(guī)定了微生物限度試驗法，其中包括測量活菌數(shù) 的活菌數(shù)試驗和與特定的病原性微生物等相關(guān)的特定微生物試驗。進而，對于生藥，一般試 驗法5. 02中的生藥試驗法中規(guī)定了生藥的微生物限度試驗法。但是，在將微生物限度試驗 法應(yīng)用到中藥提取物制劑及作為其原料的生藥的情況下，因它們中所含的抗菌性物質(zhì)（包 含抗真菌性物質(zhì)，以下同樣）的影響而對象微生物的生長繁殖受到抑制，因此存在無法準 確地檢測對象微生物的問題。
[0003] 為了除去被測試樣的抗菌活性，通常想到的是將抗菌活性滅活（抑制物質(zhì)的中 和）、提高試樣液的稀釋率或者增加培養(yǎng)基的量、膜過濾等。但是，由于中藥提取物制劑及作 為其原料的生藥等中含有多種抗菌性物質(zhì)，因此利用特定的滅活劑將所述抗菌性物質(zhì)有效 地滅活是極其困難的。例如，已知有為了滅活抗菌性物質(zhì)而在培養(yǎng)基中添加卵磷脂和聚山 梨醇酯的方法，然而雖然相對于對羥基苯甲酸酯類、汞等防腐劑的滅活可獲得高的效果，但 對于中藥提取物制劑的滅活，大多無法獲得充分的效果。實際上，在作為中藥原料的生藥中 含有從低分子到高分子的多種化合物，并且，這些化合物大多從分子結(jié)構(gòu)方面看是特征性 的成分（萜類化合物、生物堿、黃酮類化合物、醌類、氨基酸、脂肪酸、糖類等），且含有許多 抗菌性物質(zhì)（萜類化合物、生物堿、黃酮類化合物、鞣酸類等）。由于中藥提取物制劑包含多 種生藥，因此含有廣范圍的很多抗菌性物質(zhì)。進而，中藥提取物制劑由于其制法而含有許多 不溶性微粒，無法使用用于除去抗菌性物質(zhì)的通用的膜過濾。另一方面，若提高稀釋率或增 加培養(yǎng)基的量，則靈敏度降低，因此不能說是應(yīng)當優(yōu)先選擇的方法。
[0004] 針對這樣的問題，本申請人已經(jīng)提出了通過在培養(yǎng)基中添加活性炭和酸性白土或 活性白土來除去被測試樣中的抗菌性物質(zhì)的方法（專利文獻1)。該方法雖然在特定微生物 試驗中有用，但在利用使用瓊脂培養(yǎng)基的瓊脂平板混釋法（plate-count method)的活菌數(shù) 試驗中，培養(yǎng)基因活性炭而著色，并且培養(yǎng)基的透明度因酸性白土或活性白土而下降，因此 難以識別菌落。進而，由于不易將這些物質(zhì)分離除去，因此存在難以準確地識別菌落而進行 測量的問題。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0006] 專利文獻
[0007] 專利文獻1 :國際公開第2008/038625小冊子

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明要解決的問題
[0009] 因此，期望開發(fā)出一種對含有多種抗菌性物質(zhì)的中藥提取物制劑、生藥，在同一試 驗條件下可適用于特定微生物試驗和活菌數(shù)試驗這兩者而通用性高、能夠有效地降低被測 試樣中的抗菌性物質(zhì)的影響、可高精度地檢測對象微生物的微生物檢測方法，本發(fā)明的課 題是提供這樣的微生物檢測方法。
[0010] 用于解決問題的方案
[0011] 本發(fā)明人等為解決上述課題而認真研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（甲基）丙烯酸酯系合成吸附 劑能夠?qū)⒈粶y試樣中所含的各種抗菌性物質(zhì)吸附除去，由于對微生物發(fā)育所需的營養(yǎng)成分 的吸附作用弱，因此可在不抑制對象微生物的發(fā)育的情況下提高檢測精度，進而即使添加 該吸附劑，培養(yǎng)基也不著色，吸附劑在作用之后也能夠容易地被清除，因此利用瓊脂平板混 釋法等也能進行準確的測量，從而完成了本發(fā)明。
[0012] 即，本發(fā)明為具有抗菌活性的被測試樣中的微生物檢測方法，其特征在于，包括： 制備含有具有抗菌活性的被測試樣的試樣液的工序和用培養(yǎng)基培養(yǎng)對象微生物的工序，在 所述微生物檢測方法中，使（甲基）丙烯酸酯系合成吸附劑作用于試樣液和/或培養(yǎng)基。
[0013] 發(fā)明的效果
[0014] 本發(fā)明的微生物檢測方法由于有效地將被測試樣中所含的抗菌性物質(zhì)吸附除去， 因此可在培養(yǎng)時不抑制對象微生物的發(fā)育的情況下準確而精度良好地檢測對象微生物。另 外，由于能夠降低各種抗菌性物質(zhì)的影響，因此作為檢測對象的微生物的范圍廣，而且可適 用于很多中藥提取物制劑或生藥等，適用對象廣泛、通用性高。進而，即使在培養(yǎng)基中添加 本發(fā)明所使用的（甲基）丙烯酸酯系合成吸附劑，培養(yǎng)基也不著色或不透明化，吸附劑在作 用之后也能夠容易地被分離除去，因此利用瓊脂平板混釋法等也能夠準確地識別菌落，可 迅速、準確地測量。
【附圖說明】
[0015] 圖1是在實施例6中，以大黃甘草湯為被測試樣，將枯草桿菌(Bacillus subtilis)的添加回收率對稀釋倍數(shù)作圖而成的圖表。
[0016] 圖2是在實施例6中，以大承氣湯為被測試樣，將枯草桿菌的添加回收率對稀釋倍 數(shù)作圖而成的圖表。
【具體實施方式】
[0017] 本發(fā)明方法是用于檢測具有抗菌活性的被測試樣中的微生物的方法，其特征在 于，該方法包括制備含有被測試樣的試樣液的工序和用培養(yǎng)基培養(yǎng)對象微生物的工序，在 所述方法中，使（甲基）丙烯酸酯系合成吸附劑作用于試樣液制備工序中的試樣液和培養(yǎng) 工序中的培養(yǎng)基中的任意一者或兩者。
[0018] 作為具有抗菌活性的被測試樣（以下，有時簡稱為"被測試樣"），可以舉出中藥 提取物制劑、生藥等。中藥提取物制劑是對用水、乙醇等水溶性溶劑提取中藥處方而成的 提取物成分進行制劑化而成的制劑，對其劑型沒有特別限定，為粉末、顆粒劑、片劑、液體制 劑、丸劑、膠囊劑等均可。另外，中藥是古代中國所著的醫(yī)學(xué)書中所記載的生藥的配混比、 使用的標準（癥狀）傳到日本并獨自地發(fā)展而成的，中藥處方是根據(jù)處方來決定生藥的種 類和配混比例。作為中藥處方的具體例，可以例示葛根湯、葛根湯加川芎辛夷、乙字湯、安 中散、十味敗毒湯、八味地黃丸、大柴胡湯、小柴胡湯、柴胡桂枝湯、柴胡桂枝干姜湯、柴胡加 龍骨牡蠣湯、半夏瀉心湯、黃連解毒湯、半夏厚樸湯、五苓散、桂枝加術(shù)附湯、小青龍湯、防已 黃芪湯、小半夏加茯苓湯、消風(fēng)散、當歸芍藥散、加味逍遙散、桂枝茯苓丸、桂枝加龍骨牡蠣 湯、麻黃湯、越婢加術(shù)湯、麥門冬湯、真武湯、吳茱萸湯、人參湯、大黃牡丹皮湯、白虎加人參 湯、四逆散、木防已湯、半夏白術(shù)天麻湯、當歸四逆加吳茱萸生姜湯、苓桂術(shù)甘湯、豬苓湯、補 中益氣湯、六君子湯、桂枝湯、七物降下湯、釣藤散、十全大補湯、荊芥連翹湯、潤腸湯、薏苡 仁湯、疏經(jīng)活血湯、抑肝散、麻杏甘石湯、五淋散、溫清飲、清上防風(fēng)湯、治頭瘡一方、桂枝加 茍藥湯、桃核承氣湯、防風(fēng)通圣散、五積散、炙甘草湯、歸脾湯、參蘇飲、女神散、茍藥甘草湯、 茯苓飲、香蘇散、四物湯、甘麥大棗湯、柴陷湯、調(diào)胃承氣湯、四君子湯、龍膽瀉肝湯、芎歸膠 艾湯、麻杏薏甘湯、平胃散、柴胡清肝湯、二陳湯、桂枝人參湯、抑肝散加陳皮半夏、大黃甘草 湯、神秘湯、當歸飲子、六味丸、二術(shù)湯、治打撲一方、清肺湯、竹茹溫膽湯、滋陰至寶湯、滋陰 降火湯、五虎湯、柴樸湯、大防風(fēng)湯、黃芪建中湯、小建中湯、大建中湯、升麻葛根湯、當歸湯、 酸棗仁湯、辛夷清肺湯、通導(dǎo)散、溫經(jīng)湯、牛車腎氣丸、人參養(yǎng)榮湯、小柴胡湯加桔梗石膏、立 效散、清心蓮子飲、豬苓湯合四物湯、三黃瀉心湯、柴苓湯、胃苓湯、茯苓飲合半夏厚樸湯、茵 陳五苳散、苳姜術(shù)甘湯、苳甘姜味辛夏仁湯、黃連湯、三物黃苳湯、排膿散及湯、當歸建中湯、 川考茶調(diào)散、桂枝茯苳丸加薏該仁、麻子仁丸、麻黃附子細辛湯、啟脾湯、大承氣湯、桂枝加 芍藥大黃湯、茵陳蒿湯、清暑益氣湯、加味歸脾湯、桔梗湯等，這些中藥處方的生藥的組合、 配混比率被記載于"漢方醫(yī)薬品集"（財団法人日本醫(yī)薬情報七y夕一編，平成23年出版）、 "改訂一般用漢方処方ω手引g "（財団法人日本公定書協(xié)會監(jiān)修，日本漢方生薬製剤協(xié)會 編，平成21年出版）等。
[0019] 另外，生藥是對動植物的藥用部分、細胞內(nèi)容物、分泌物、提取物或礦物進行清洗、 去皮、切斷、干燥、篩選等加工后而得到的物質(zhì)。作為具體例，可以例示阿膠、棕兒茶、大茴 香籽、威靈仙、茵陳蒿、淫羊藿、茴香、烏藥、延胡索、黃芪、黃芩、黃柏、櫻皮、黃連、遠志、艾 葉、訶子、何首烏、葛根、滑石、兒茶、洋甘菊、瓜蔞根、瓜蔞仁、干姜、甘草、桔梗、枳實、菊花、 纈草根、羌活、杏仁、金銀花、枸杞子、苦參、荊芥、桂皮、決明子、老鶴草、膠飴、紅花、香附子、 粳米、厚樸、牛黃、牛膝、吳茱萸、牛蒡子、胡麻、五味子、柴胡、細辛、山楂、山梔子、山茱萸、山 椒、酸棗仁、山藥、地黃、地骨皮、紫根、蒺藜子、炙甘草、芍藥、車前子、車前草、庶蟲、十藥、縮 砂、生姜、松藤、小麥、菖蒲根、升麻、辛夷、神曲、石決明、石膏、川芎、石楠葉、美遠志、前胡、 川骨（nuphar rhizome)、蝴銳、番瀉葉、蒼術(shù)、阜角刺、桑白皮、桑根皮、蘇木、蘇葉、大黃、 大率、澤瀉、竹節(jié)、竹節(jié)人參、知母、茶葉、丁香、釣藤鉤、豬苳、陳皮、天南星、天麻、天門冬、 橙花、冬瓜子、當歸、橙皮、桃仁、當藥、獨活、杜仲、動物膽、人參、忍冬、貝母、麥芽、麥門冬、 巴豆、薄荷、北沙參、半夏、百合、白芷、白術(shù)、枇杷葉、檳榔、茯苓、附子、制附子（Specific Processed Aconite Root)、加工附子（Powdered Processed Aconite Root)、防已、茅根、芒 硝、防風(fēng)、樸嗽、牡丹皮、蛇麻草、牡、麻黃、麻子仁、蜜蜂花葉、木通、木防已、木香、益智、益 母草、熊膽、薏該仁、薰衣草花、龍眼肉、龍骨、龍膽、良姜、連翹、蓮子和羌活等，大黃、甘草和 黃連特別有用。
[0020] 制備含有上述被測試樣的試樣液。在被測試樣為液體的情況下，可以將其直接作 為試樣液。在被測試樣為固態(tài)物質(zhì)的