一種從茶葉末中提取分離5-o-沒食子?？鼘幩岬姆椒?br>【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及茶萃出物，具體涉及從茶葉中分離茶多酚的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 茶多酚是茶葉的主要活性成分，是一類具有抗衰老、預(yù)防癌癥和降血糖血脂的功 效的酚類物質(zhì)的總稱。5-0-沒食子?？鼘幩幔?-0-Galloylquinicacid)是茶多酚中的一 個(gè)具體化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下式I所示。5-0-沒食子?？鼘幩峋哂酗@著的抗氧化能力， 是一種潛在的食品或化妝品添加劑；在疾病治療方面，研究表明5-0-沒食子?？鼘幩釋?duì) 利什曼?。ê跓岵。┚哂泻芎玫寞熜В↙.R.F.deSousa,S.D.Ramalho,J.B.Fernandes,M. F.D.F.daSilva,M.R.D.lemma,C.J.Correa,D.H.F.deSouza,Μ.I.S.Lima,P. C.Vieira,LeishmanicidalGalloylquinicAcidsareNoncompetitiveInhibitors ofArginase，JBrazilChemSoc, 25 (2014) 1832-1838.);此外，5-0-沒食子?？鼘幩崤c 3, 4, 5-三-0-沒食子?？鼘幩峋哂蓄愃平Y(jié)構(gòu)，后者具有一定的抗癌活性，因此，5-0-沒食子 ?？鼘幩徇€可能具有預(yù)防和治療癌癥的功效。
[0003]
[0004] 目前，有多種提取分離茶葉中的茶多酚的方法，但除高效液相色譜法外，其制品均 為多種酚類物質(zhì)的混合物，不能直接制得單體化合物5-0-沒食子?？鼘幩?，且對(duì)5-0-沒食 子?？鼘幩岬幕厥章蕵O低。
[0005] 高效液相色譜法是目前唯一可以直接用于分離出高純度5-0-沒食子?？鼘幩岬?方法，但是該方法存在對(duì)儀器設(shè)備要求高、產(chǎn)品成本高和難以進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)的不足，因此 急需發(fā)展一種操作簡(jiǎn)便、可以進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)的分離方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從茶葉末中 提取分離5-0-沒食子?？鼘幩岬姆椒?，該方法具有操作簡(jiǎn)便、對(duì)生產(chǎn)設(shè)備要求低的優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的方案是：
[0008] -種從茶葉末中提取分離5-0-沒食子?？鼘幩岬姆椒?，該方法由以下步驟組成：
[0009] (1)取茶葉末，按lg: 10~20ml的固液比加入體積濃度為50~90%的乙醇溶 液，超聲提取，提取液經(jīng)濾膜過濾，得到粗提液；
[0010] (2)按1ml粗提液加入0. 1~lg磷酸鋯的比例往粗提液中加入磷酸錯(cuò)，搖床振蕩 6~24h，離心分離出液體，磷酸鋯用水洗滌；
[0011] (3)按0.lg: 1ml固液比往洗滌后的磷酸鋯中加入重量濃度為0. 4%的磷酸去離 子水溶液，搖床振蕩10~24h，離心分離得到脫附液，濾膜過濾，濾液冷凍干燥，即得5-0-沒 食子酰奎寧酸；
[0012] 上述步驟（2)所述的磷酸鋯制備方法如下：
[0013] A)取固體ZrOCl2 ·8Η20溶于去離子H20后，在攪拌下緩慢加入固體（NH4)2C03至溶 液澄清；再加入（ΝΗ4)2ΗΡ04，完全溶解后加入CTAB，得到澄清反應(yīng)液；所述CTAB為十六烷基 三甲基溴化銨；
[0014] 其中，所用ZrOCl2 · 8H20、（NH4)2HP04、CTAB和H20 的摩爾比為 Zr0Cl2.8H20 : (NH4)2HP04:CTAB:H20 = 1 : 0.25 ~2.5 : 0.25 : 1000;
[0015] B)將該澄清反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到不銹鋼反應(yīng)釜中，加熱至80°C反應(yīng)2天，90°C反應(yīng)1天， 120°C反應(yīng)1天；反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至常溫，離心得到磷酸鋯固體，用去離子水洗滌至pH= 7,在80°C的條件下烘干，再于550°C的條件下煅燒6小時(shí)，即得白色磷酸鋯。
[0016] 本發(fā)明所述的從茶葉末中提取分離5-0-沒食子酰奎寧酸的方法中，所述的超聲 提取的功率與物料體積比為2.5~5W:lml，超聲提取的時(shí)間為40~80min。
[0017] 本發(fā)明所述的從茶葉末中提取分離5-0-沒食子?？鼘幩岬姆椒ㄖ?，步驟（2)和 (3)中所述的搖床震蕩的工作溫度37°C，轉(zhuǎn)速為150rpm。
[0018] 本發(fā)明所述的從茶葉末中提取分離5-0-沒食子?？鼘幩岬姆椒ㄊ褂貌枞~末為原 料，在乙醇溶液中超聲提取后，選擇磷酸鋯為特異選擇性吸附劑，經(jīng)過吸附、洗滌、脫附和凍 干，不僅可制備純度大于90%的5-0-沒食子?？鼘幩?，且回收率較高。本發(fā)明所述的方法 除乙醇外，沒有使用其他任何有機(jī)試劑，是一種環(huán)境友好型的分離方法。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn) 單、無需投入昂貴的生產(chǎn)設(shè)施、產(chǎn)品成本低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明所述方法得到的5-0-沒食子?？鼘幩岬腅SI-MS圖譜。
[0020] 圖2為本發(fā)明所述方法得到的5-0-沒食子?？鼘幩岬腘MR圖譜。
[0021] 圖3為本發(fā)明所述方法得到的5-0-沒食子?？鼘幩岬腍PLC圖譜。
【具體實(shí)施方式】 [0022] 實(shí)施例1
[0023] -、磷酸鋯的制備：
[0024] 1、取3. 58g固體ZrOCl2 · 8H20溶于200ml的去離子水后，加入7. 56g固體 (NH4)2C03，連續(xù)攪拌至溶液澄清；再加入2. 94g的（ΝΗ4)2ΗΡ04，完全溶解后加入十六烷基三 甲基溴化銨（CTAB) 1.Olg，得到澄清反應(yīng)液。其中，原料ZrOCl2 · 8H20、（NH4)2HP04、CTAB和 H2〇 的摩爾比為ZrOCl2 · 8H20 : (NH4) 2HP04 :CTAB:Η20 = 1 : 2 : 0· 25 : 1000。
[0025] 2、將該澄清反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到不銹鋼反應(yīng)釜中，加熱至80°C反應(yīng)2天，90°C反應(yīng)1天， 120°C反應(yīng)1天；反應(yīng)結(jié)束后，冷卻反應(yīng)釜至常溫，5000rpm離心得到的磷酸鋯固體用去離子 水洗滌至pH= 7,在烘箱中80°C烘干12h，于馬弗爐中550°C煅燒6小時(shí)，即得白色磷酸鋯。
[0026] 二、5-0-沒食子?？鼘幩岬奶崛》蛛x：
[0027] 1、取過40目篩的太平猴魁茶葉粉末lg，加入體積濃度為70%的乙醇溶液10mL，在 50W/45kHz下超聲提取60min;提取液經(jīng)0. 45μm濾膜過濾后，得到粗提液。
[0028] 2、按1ml粗提液加入0. 4g磷酸鋯的比例往粗提液中加入步驟一得到的磷酸錯(cuò)，在 37°C/150rpm的條件下，于震蕩搖床上振蕩吸附24小時(shí)；4000rpm離心1分鐘，分離出的磷 酸鋯用l〇ml蒸餾水洗滌5次，得到洗滌后的磷酸鋯。
[0029] 3、按0.lg洗滌后的磷酸鋯中加入lml重量濃度為0. 4%的磷酸去離子水溶液的比 例往磷酸鋯中加入磷酸去離子水溶液，在37°C/150rpm條件下，于震蕩搖床上振蕩脫附24 小時(shí)；4000rpm離心1分鐘后，得到的脫附液用0. 22μm濾膜過濾，濾液經(jīng)冷凍干燥后得到 白色粉末〇· 36mg。
[0030] 三、產(chǎn)物的鑒定：
[0031] 將制備的白色粉末溶于0. 1%的甲酸溶液后，電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS)，其ESI-MS 圖譜如圖1所示，測(cè)得粉末中主要成分的荷質(zhì)比（m/Z)[M-H]為343. 00,結(jié)合已有文獻(xiàn) (C.Y.ffu,H.R.Xu,J.Heritier,ff.Andlauer,Determinationofcatechinsandflavonol glycosidesinChineseteavarieties,FoodChem，132 (2012) 144-149·)，初步確定其結(jié) 構(gòu)為5-0-沒食子?？鼘幩?。
[0032] 為進(jìn)一步確定其結(jié)構(gòu)，將制備的白色粉末溶于氘代甲醇（CD30D)后，對(duì)其進(jìn)行 NMR分析，其NMR圖譜如圖 2 所示，結(jié)果如下"HNMR(600MHz,CD30D) :δ7. 04(s, 2H), 5. 39 (d,J= 4. 1Hz, 1H), 4· 18 (s, 1H), 3· 77 (dd,J= 8. 0Hz, 1H), 2· 26-2. 02 (m, 4H)，該圖譜與文 獻(xiàn)（K.W.Cheng,R.Y.Yang,S.C.S.Tsou，C.S.C.Lo,C.Τ·Ho,T.C.Lee,M.F.Wang,Analysis ofantioxidantactivityandantioxidantconstituentsofChinesetoon,JFunct Food, 1 (2009) 253-259.)對(duì)5-0-沒食子?？鼘幩岬膱?bào)道一致。結(jié)合文獻(xiàn)中對(duì)5-0-沒食子 ?？鼘幩岬膱?bào)道，及其MS和NMR結(jié)果，確定本實(shí)驗(yàn)分離得到的產(chǎn)物為5-0-沒食子?？鼘?酸。
[0033] 四、產(chǎn)物的純度檢測(cè)：
[0034] 以制備的白色粉末狀5-0-沒食子?？鼘幩釣闃悠?、以武漢天植生物技術(shù)有限公 司生產(chǎn)的5-0-沒食子?？鼘幩釣闃?biāo)準(zhǔn)品，分別溶于0. 4%的磷酸水溶液后，使用高效液相 色譜對(duì)其純度進(jìn)行分析。上述分析的色譜條件為：流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為0. 4%的磷 酸/蒸餾水溶液；〇~14分鐘，流動(dòng)相A由5 %的梯度增加到15 %，14~25分鐘，流動(dòng)相A 保持15 %梯度不變，25~53分鐘，流動(dòng)相A由15 %的梯度增加到35 %，53~65分鐘，流動(dòng) 相A由35%梯度增加到85%;檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm，流速為0. 7ml/min。結(jié)果測(cè)得白色粉末產(chǎn) 物中5-0-沒食子?？鼘幩岬暮繛?1. 46%，即所得化合物5-0-沒食子?？鼘幩岬募兌葹?91. 46%〇
[0035] 上述純度檢測(cè)過程中，所得樣品的HPLC圖譜如圖3所示。
[0036] 五、回收率的檢測(cè)：
[0037]回收率按以下公式計(jì)算：
[0038]
[0039] 式中，m為產(chǎn)物的質(zhì)量；P為產(chǎn)物中5-0-沒食子?？鼘幩岬募兌?；Μ為1ml上述 5-0-沒食子?？鼘幩岬奶崛》蛛x中步驟1所得到的茶葉末粗提液內(nèi)5-0-沒食子?？鼘幩?的含量，該含量是將所述茶葉末粗提液進(jìn)行高效液相色譜定量分析得到。所述高效液相色 譜定量分析的色譜條件與上述產(chǎn)物的純度檢測(cè)的色譜條件相同。定量檢測(cè)結(jié)果，本例所述 方法5-0-沒食子?？鼘幩岬幕厥章?8. 39%。
[0040] 實(shí)施例2
[0041] -、磷酸鋯的制備：
[0042] 本實(shí)施例中磷酸鋯制備方法與實(shí)施例1的不同之處在于：原料ZrOCl2 · 8H20、 (NH4) 2HP0