羧基改性漂珠固定化漆酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羧基改性漂珠固定化漆酶及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是含有四個(gè)銅離子的多酚氧化酶，屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族。漆酶主要分布在一些高等植物如漆樹(shù)及一些真菌如白腐菌中，不同來(lái)源的漆酶結(jié)構(gòu)上也不盡相同，因此其生物特性也有差異。漆酶能夠降解多種酚類(lèi)和芳胺類(lèi)化合物，具有良好的底物專一性和穩(wěn)定性，因而在廢水處理、生物漂白和生物傳感器構(gòu)建等方面具有重要的應(yīng)用前景。由于游離漆酶易溶于水，酶存活時(shí)間短，活性不穩(wěn)定，使用后不易回收再利用，限制了其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0003]酶的固定化技術(shù)是實(shí)現(xiàn)酶連續(xù)使用和改善酶穩(wěn)定性的有效手段。固定化酶與游離酶相比具有很多優(yōu)點(diǎn)，它能夠延長(zhǎng)酶的使用壽命，提高酶的穩(wěn)定性及其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，因而能夠克服直接使用游離酶的不足。
[0004]固定化漆酶是指將水溶性漆酶以物理或化學(xué)的方法固定在有機(jī)或無(wú)機(jī)的載體上，形成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物。常用的載體有多孔玻璃、殼聚糖、硅藻鹽和纖維素等。固定化漆酶的制備方法主要有吸附法、包埋法、共價(jià)鍵鍵合法和交聯(lián)結(jié)合法。吸附法是指將酶液與石墨、碳纖維、過(guò)渡金屬或其氧化物等活潑載體接觸，使酶通過(guò)分子間相互作用力吸附在載體上的固定化方法。物理吸附的優(yōu)點(diǎn)在于其操作簡(jiǎn)單、造價(jià)低廉、固定化酶初始活性較高，但固定化酶容易因酶和載體結(jié)合力不強(qiáng)，脫落而失活。包埋法是將漆酶物理包埋于高聚物網(wǎng)格內(nèi)或微囊內(nèi)的方法，一般反應(yīng)條件溫和，對(duì)酶自身的結(jié)構(gòu)改變很少，因此酶活性損失較小，但包埋法處理的固定化酶僅適合于底物和產(chǎn)物均為小分子的催化反應(yīng)，對(duì)有大分子參與的催化反應(yīng)過(guò)程較差。交聯(lián)法就是借助雙功能團(tuán)或多功能團(tuán)試劑，使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)固定化酶的方法，由于交聯(lián)法反應(yīng)條件劇烈，單獨(dú)使用交聯(lián)法固定化漆酶的效果不佳。共價(jià)鍵鍵合法是指酶分子上的非活性官能團(tuán)與載體上的活化基團(tuán)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的化學(xué)共價(jià)鍵的方法，使酶與載體形成牢固結(jié)合，不易發(fā)生酶的脫落，但共價(jià)鍵鍵和法存在反應(yīng)條件較為苛刻，加工工藝較長(zhǎng)，固定化效率較低的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有方法的缺點(diǎn)，提供一種操作簡(jiǎn)單，條件溫和的固定化漆酶及其制備方法，該固定化漆酶可以方便、高效率的去除水中的染料等有機(jī)污染物。
[0006]本發(fā)明的一種羧基改性漂珠固定化漆酶的制備方法，其特征按如下步驟實(shí)施:
[0007](I)胺基改性漂珠的制備:
[0008]粉煤灰漂珠經(jīng)200目和250目的不銹鋼篩子篩分，取粒徑為200-250目之間的顆粒。放入2mol/L的鹽酸溶液中浸泡洗滌60min，水洗去除酸液后，放入烘箱烘干，備用。取經(jīng)過(guò)酸洗的漂珠放入異丙醇與去離子水的混合溶液中，攪拌形成懸浮液，在室溫條件下滴加胺基硅烷的醇水溶液，滴加完畢后，繼續(xù)反應(yīng)12-24h。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾分離得到的固體，用醇水混合溶液洗滌顆粒表面，去掉未反應(yīng)的胺基硅烷，得到的固體即為胺基改性漂珠。
[0009](2)羧基改性漂珠的制備:
[0010]在燒瓶中加入N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)、胺基改性漂珠，向其中滴加馬來(lái)酸酐的DMF溶液，滴加結(jié)束后，在室溫下24-48h。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾分離得到的固體，用DMF洗滌顆粒表面，去掉未反應(yīng)的馬來(lái)酸酐，得到的固體即為羧基改性漂珠。
[0011](3)羧基改性漂珠固定化漆酶的制備:
[0012]在燒瓶中加入0.2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6.0)，羧基改性漂珠和漆酶溶液，在室溫條件下攪拌吸附固化24-48h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾分離，用緩沖液反復(fù)洗滌，直至上清液中檢測(cè)不到蛋白質(zhì)。得到的固體顆粒即為羧基改性漂珠固定化漆酶，保存于4°C的冰箱中備用。
[0013]上述所述(I)中胺基硅烷可以是γ-胺丙基三乙氧基硅烷、γ-胺丙基三甲氧基硅烷、Ν-(β-氨乙基)-γ-胺丙基三乙氧基硅烷、苯胺基甲基三乙氧基硅烷、苯胺基甲基三甲氧基硅烷中的一種或二種混合物。
[0014]上述所述⑴中漂珠與胺基硅烷的質(zhì)量比為(8-2): I。
[0015]上述所述(2)中胺基改性漂珠與馬來(lái)酸酐的質(zhì)量比為1: (5-12)。
[0016]上述所述(3)中漆酶溶液為將漆酶溶解于0.lmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6.0)，質(zhì)量濃度為20g/L。
[0017]上述所述(3)中羧基改性漂珠與漆酶溶液的質(zhì)量比為1: (2-10)。
[0018]本發(fā)明的羧基改性漂珠中含有大量游離的羧基官能團(tuán)，羧基官能團(tuán)能夠與漆酶分子結(jié)構(gòu)中的胺基形成靜電結(jié)合，形成固定化漆酶，提高漆酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率，羧基改性漂珠固定化漆酶可以直接用于含有染料等有機(jī)廢水中。由于漂珠具有良好的機(jī)械性能和漂浮性能，使用過(guò)程中適當(dāng)?shù)臋C(jī)械攪拌作用可形成懸浮體系，催化反應(yīng)結(jié)束后，撤掉機(jī)械攪拌作用，固定化漆酶即可漂浮在溶液表層，極易進(jìn)行機(jī)械分離。
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1
[0021]粉煤灰漂珠經(jīng)200目和250目的不銹鋼篩子篩分，取粒徑為200-250目之間的顆粒。將20g漂珠放入2mol/L的鹽酸溶液10mL中浸泡洗滌60min，水洗去除酸液后，放入烘箱烘干，備用。取酸洗漂珠5g放入50mL異丙醇與去離子水的混合溶液(9: I)中，開(kāi)啟磁力攪拌，使之形成懸浮液。在室溫條件下滴加1g質(zhì)量濃度為10%的γ-胺丙基三乙基硅烷醇水溶液(異丙醇:去離子水=9: 1)，滴加完畢后，繼續(xù)反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾分離得到的固體，用醇水混合溶液洗滌顆粒表面3-5次，去掉未反應(yīng)的胺基硅烷，得到的固體即為胺基改性漂珠。
[0022]在燒瓶中加入10mL DMF、5g胺基改性漂珠，向其中滴加28g馬來(lái)酸酐的DMF溶液(5mol/L)，滴加結(jié)束后，在室溫下24h。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾分離得到的固體，用DMF洗滌顆粒表面，去掉未反應(yīng)的馬來(lái)酸酐，得到的固體即為羧基改性漂珠。
[0023]在燒瓶中加入0.2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6.0)50mL，羧基改性漂珠5g、漆酶溶液25mL，在室溫條件下攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾