確定可變區(qū)擴(kuò)增引物是否存在偏向性的方法和裝置及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及確定可變區(qū)擴(kuò)增引物是否存在偏向性的 方法和裝置及其應(yīng)用，更具體地，涉及確定可變區(qū)擴(kuò)增引物是否存在偏向性的方法和裝置、 擴(kuò)增可變區(qū)的方法和設(shè)備、W及測序方法和系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] B細(xì)胞受體度CR)和T細(xì)胞受體（TCR)的多樣性構(gòu)成了龐大的免疫組庫，保證了機(jī) 體可W有效的識別和防御潛在的病原體。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)主要通過克隆性的擴(kuò)增可W特異 性的識別抗原的T細(xì)胞或B細(xì)胞來發(fā)生作用，所W準(zhǔn)確的定量每一種T細(xì)胞或B細(xì)胞豐度 對了解免疫系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)變化是非常重要的。BCR和TCR對抗原的識別主要是通過可變區(qū)來 識別的，其中互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)起到尤為重要的作用。
[000引從基因水平上來說免疫組庫的多樣性主要是通過BCR和TCR可變區(qū)胚系基因片段 的組合多樣性，T、B細(xì)胞在發(fā)育成熟過程中的V、D、J基因重排連接多樣性W及重排過程中 基因末端的變異送幾種機(jī)制產(chǎn)生的。在高通量測序技術(shù)（HT巧出現(xiàn)W前，人們就知道T細(xì) 胞及B細(xì)胞抗原受體基因具有非常高的多樣性，但是無法得知抗原受體基因組的情況。高 通量測序使測定復(fù)雜的適應(yīng)性免疫分子成為可能，并展示了巨大的優(yōu)勢，通過高通量免疫 組庫測序技術(shù)，我們可W很容易的了解個(gè)體的免疫組庫多樣性情況，獲得抗原受體基因組 的信息。該技術(shù)分別在T/B細(xì)胞受體的V基因和J(或C)基因區(qū)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增富集 代表T/B細(xì)胞多樣性的CDR3區(qū)域，然后分析測序得到的數(shù)十萬條T/B細(xì)胞受體序列的多樣 性情。
[0004] 但是由于TCR和BCR可變區(qū)編碼基因由V基因、D基因、J基因、C基因組成，每一 個(gè)基因有多個(gè)不同胚系基因，需要設(shè)計(jì)多對引物同時(shí)多CDR3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。而多對引物在同 一個(gè)反應(yīng)體系中會(huì)相互干擾，并產(chǎn)生假陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物，影響多免疫組庫多樣性的準(zhǔn)確測 定。所W開發(fā)一種可W準(zhǔn)確的評價(jià)多重PCR擴(kuò)增偏向性及假陽性的方法是非常必要的。
[0005] 然而，目前關(guān)于確定多重PCR擴(kuò)增偏向性及假陽性的研究仍有待深入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的 一個(gè)目的在于提出一種有效確定可變區(qū)擴(kuò)增引物是否存在偏向性的方法。
[0007] 本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[000引成熟T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原受體燈CR和BCR)可變區(qū)基因組成如圖1所示，由重排 后的V、D、J基因組成，之后是恒定區(qū)的C基因。V基因根據(jù)功能可W分成FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3五個(gè)區(qū)域；整個(gè)可變區(qū)的長度為50-1000個(gè)堿基對化P)，平均長度為400-5(K)bp。 V基因部分區(qū)域、D基因（輕鏈無D基因）、J基因部分區(qū)域、隨機(jī)插入片段（腳組成CDR3區(qū) 域，該區(qū)域在抗原識別過程中發(fā)揮最重要的作用，多樣性最高。V基因由20-600個(gè)核巧酸 組成，J基因由15-300個(gè)核巧酸組成。對于基因組DM樣品來說，J基因和C基因之間由 內(nèi)含子隔開，對于表達(dá)的信使RNA樣品來說，J基因和C基因的內(nèi)含子被剪切掉，J基因和C 基因如圖1所示連接在一起。
[0009] 高通量免疫組庫測序是在V區(qū)和J區(qū)設(shè)計(jì)引物（對于信使RNA來說，也可W在V區(qū) 和C區(qū)設(shè)計(jì)引物），多重PCR擴(kuò)增可變區(qū)。V區(qū)的最佳引物設(shè)計(jì)方法是將引物設(shè)計(jì)在FR1區(qū) 域，反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)在J區(qū)的FR4區(qū)，對于RNA樣品，反向引物也可W設(shè)計(jì)在C基因區(qū)。因 為送樣可W擴(kuò)增到整個(gè)可變區(qū)的DNA序列，同時(shí)FR1區(qū)的多樣性比較低，只需要少量的引物 就可W擴(kuò)增所有的V基因。但是由于擴(kuò)增產(chǎn)物較長巧O-lOOObp，平均400-5(K)bp)，需要用讀 長較長的測序平臺才可W讀到所有的核巧酸，如IlluminaMiseq測序平臺，Roche454測序 平臺。但送些測序平臺測序成本都比較高，不適合大量樣本測序。目前一般免疫組庫測序只 對CDR3區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增和測序，正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)在V區(qū)的FR3區(qū)域，反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)在J 區(qū)的FR4區(qū)，對于RNA樣品，反向引物也可W設(shè)計(jì)在C基因區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為50-300bp，可 W用通量比較高，成本比較低的Illumin址iseq平臺或LifeTechnologies的IonProton 平臺測序。而在多重PCR過程中多對引物之間會(huì)相互影響，造成擴(kuò)增的偏差化ias)。
[0010] 為了解決上述技術(shù)問題，在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種確定可變區(qū)擴(kuò) 增引物是否存在偏向性的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：（1)利用通用引物組對 含有可變區(qū)的核酸樣本進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，W便獲得所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物；（2)對所述第一擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行第一測序，W便獲得所述第一測序結(jié)果，（3)利用候選引物組對所述第一擴(kuò)增產(chǎn) 物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，W便獲得第二擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)對所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二測序，W 便獲得第二測序結(jié)果；W及（5)將所述第二測序結(jié)果與素所述第一測序結(jié)果進(jìn)行比較，W 便確定所述候選引物組是否存在偏向性，其中，候選引物組包括候選正向引物和候選反向 引物，所述通用引物組包括通用正向引物和通用反向引物，所述通用正向引物的識別位點(diǎn) 在所述候選正向引物的識別位點(diǎn)的上游，所述通用反向引物的識別位點(diǎn)在所述候選反向引 物的識別位點(diǎn)的下游。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該方法，可W有效地確定不同引物之間擴(kuò) 增的偏向性，且獲得的偏向性結(jié)果真實(shí)可靠。另外，基于得到的偏向性結(jié)果，可W調(diào)整擴(kuò)增 引物序列及引物的組合，達(dá)到將擴(kuò)增偏向性降到最低程度的效果。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述含有可變區(qū)的核酸樣本為DNA或RNA。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用讀長不低于4(K)bp的測序平臺對所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行所述第一測序，所述讀長不低于40化P的測序平臺為選自IlluminaMiSeq、Illumina MiSeqDx、IonPGM、Roche454和單分子測序平臺中的至少一種。由此，能夠有效獲得可變 區(qū)的全長測序結(jié)果。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用讀長不低于l(K)bp的測序平臺對所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行所述第二測序，所述讀長不低于10化P的測序平臺為選自Illumina化Seq、Illumina Miseq、IlluminaMiSeqDx、HiseqXteruLifeS0LiD、IonTorrent、IonPGM、IonProton、 Roche454和單分子測序平臺中的至少一種。。由此，能夠快速有效地獲得第二測序結(jié)果，且 操作方便，成本低廉。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述通用正向引物的識別位點(diǎn)和所述候選正向引物的識別 位點(diǎn)在V區(qū)，所述通用反向引物的識別位點(diǎn)和所述候選反向引物的識別位點(diǎn)在J區(qū)或C區(qū)。 由此，利用通用引物組和候選引物組可W有效擴(kuò)增基因的可變區(qū)。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述通用正向引物的識別位點(diǎn)在FRl區(qū)或FR2區(qū)，所述候選 正向引物的識別位點(diǎn)在FR3區(qū)，所述通用反向引物的識別位點(diǎn)在FR4區(qū)或者C區(qū)，所述候選 反向引物的識別位點(diǎn)在FR4區(qū)或者C區(qū)。由此，利用通用引物組可W有效擴(kuò)增可變區(qū)全長， 利用候選引物組可W有效擴(kuò)增CDR3區(qū)。
[0016] 需要說明的是，本文中所使用的術(shù)語"可變區(qū)"是指B細(xì)胞受體度CR)或T細(xì)胞受 體燈CR)中的可變區(qū)。
[0017] 在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增可變區(qū)的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施 例，該方法包括：利用前面所述的方法確定候選引物組是否存在偏向性；基于所獲得的偏 向性結(jié)果，對所述候選引物組進(jìn)行調(diào)節(jié)；W及利用調(diào)節(jié)后的候選引物組對含有可變區(qū)的核 酸樣本進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。由此，可W有效消除由引物之間的影響而引起的擴(kuò)增偏向性，獲 得的擴(kuò)增產(chǎn)物沒有明顯的偏向性，真實(shí)可靠。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述對所述候選引物組進(jìn)行調(diào)節(jié)為改變擴(kuò)增不足和擴(kuò)增過 多的候選引物的序列或者改變所述擴(kuò)增不足和擴(kuò)增過多的候選引物在所述候選引物組中 的濃度。
[0019] 在本發(fā)明的第Η方面，本發(fā)明提供了一種測序方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法 包括：利用前面所述的方法對含有可變區(qū)的核酸樣本進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，W便獲得第Η擴(kuò) 增產(chǎn)物；W及對所述第Η擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第Η測序，W便獲得第Η測序結(jié)果。由此，獲得的測 序結(jié)果真實(shí)可靠，沒有明顯的偏向性。
[0020] 在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種確定可變區(qū)擴(kuò)增引物是否存在偏向性的 裝置。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該裝置包括：第一擴(kuò)增組件，所述第一擴(kuò)增組件中設(shè)置有通用 引物組，用于對含有可變區(qū)的核酸樣本進(jìn)行第一擴(kuò)增，W便獲得所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物；第一測 序組件，所述第一測序組件用于對所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第一測序，W便獲得所述第一測 序結(jié)果，第二擴(kuò)增組件，所述第二擴(kuò)增組件中設(shè)置有候選引物組，用于對所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行第二擴(kuò)增，W便獲得第二擴(kuò)增產(chǎn)物；第二測序組件，所述第二測序組件用于對所述第二 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二測序，W便獲得第二測序結(jié)果；W及比較組件，所述比較裝置用于將所述 第二測序結(jié)果與預(yù)定的第一測序結(jié)果進(jìn)行比較，W便確定所述候選引物是否存在偏向性， 其中，所述候選引物組包括候選正向引物和候選反向引物，所述通用引物組包括通用正向 引物和通用反向引物，所述通用正向引物的識別位點(diǎn)在所述候選正向引物的識別位點(diǎn)的上 游，所述通用反向引物的識別位點(diǎn)在所述候選反向引物的識別位點(diǎn)的下游。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)， 利用本發(fā)明的該裝置，能夠有效實(shí)施前面所述的確定可變區(qū)擴(kuò)增引物是否存在偏向性的方 法，從而能夠有效確定可變區(qū)擴(kuò)增引物是否存在偏向性。
[002。 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述含有可變區(qū)的核酸樣本為DNA或RNA。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一測序組件為讀長不