一種偶聯(lián)抗體的合成、檢測方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種偶聯(lián)抗體的合成、檢測方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 重癥肌無力（myastheniagravis，MG)是由乙酰膽堿受體 (acetylcholinereceptor，AchR)抗體介導(dǎo)、T細(xì)胞依賴、補體參與的神經(jīng)-肌肉接頭處的自 身免疫性疾病，體液免疫和細(xì)胞免疫均參與其發(fā)病。引發(fā)MG癥狀的直接原因是B細(xì)胞產(chǎn)生 的AchR特異性抗體，然而該抗體的產(chǎn)生離不開AchR特異性T細(xì)胞的輔助。實驗性自身免 疫性重癥肌無力（EAMG)是研究MG發(fā)病機制及治療手段的理想模型。
[0003] 樹突狀細(xì)胞（dendriticcells，DC)是迄今發(fā)現(xiàn)功能最強的專職抗原遞呈細(xì) 胞，近年來的研究表明DC在誘導(dǎo)和維持機體免疫耐受中發(fā)揮著重要作用，尤其是未成熟 DC(immaturedendriticcells，iDC)可通過多種機制誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞耐受，在移植免 疫耐受誘導(dǎo)、自身免疫性疾病治療方面，展現(xiàn)出其獨特的應(yīng)用價值。
[0004] 為了尋求一種特異性的治療MG的方法，即在不降低機體免疫力的情況下，僅抑制 針對AchR的異常免疫應(yīng)答，本發(fā)明從iDC入手，將MG的自身抗原-AchRα1亞單位胞外段 (Ηα1-210)蛋白與DC表面特異性受體-DEC205單克隆抗體偶聯(lián)，合成Ha1-210-DEC205偶 聯(lián)抗體，體內(nèi)靶向iDC，誘導(dǎo)AchR特異性Τ細(xì)胞耐受，為MG的治療提供了新的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種偶聯(lián)抗體的合成和應(yīng)用，為MG及多種自身免疫性疾病 的治療提供新的思路和理論依據(jù)。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種偶聯(lián)抗體的合成方法，包括以下步驟：
[0007]①Ηα1-210蛋白表達(dá)、純化、鑒定：采用RT-PCR的方法從表達(dá)人AchR的細(xì)胞系 TE671中擴增AchRa1亞單位胞外段基因（Ηα1-210)，同原核表達(dá)載體pET16b連接，構(gòu)建 重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE鑒定蛋白的表達(dá)；Ni2+親和 層析柱純化表達(dá)的蛋白。
[0008] ②DEC-205單克隆抗體純化：MiniPerm系統(tǒng)中連續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)分泌DEC-205，GL-117 單克隆抗體的大鼠雜交瘤細(xì)胞，培養(yǎng)上清超濾濃縮后經(jīng)50%飽和硫酸胺沉淀，最后經(jīng)蛋白 A/G親和層析柱純化；
[0009] ③Ha1-210-DEC205偶聯(lián)抗體合成：純化后的抗體經(jīng)2-巰基乙胺·鹽酸還原后， 同異型雙功能交聯(lián)劑SMCC活化的Ha1-210蛋白混合，4°C過夜連接，SDS-PAGE鑒定偶聯(lián)抗 體的合成；ELISA分別檢測偶聯(lián)后Ha1-210蛋白以及DEC-205抗體的活性。
[0010] 本發(fā)明的另一方面，還包括Ha1-210-DEC205偶聯(lián)抗體的體外細(xì)胞系實驗方法， 包括以下步驟：
[0011] ①抗體標(biāo)記及iDC培養(yǎng)：生物素標(biāo)記表達(dá)純化的Ha1-210-DEC205、 Ha1-210-GL117偶聯(lián)抗體以及Ηα1-210;無菌取C57BL/6小鼠（B6鼠）骨髓細(xì)胞，體外誘 導(dǎo)培養(yǎng)iDC;
[0012] ②親和力檢測：將生物素標(biāo)記的偶聯(lián)抗體同iDC共孵育后以PE-Avidin染色、流式 細(xì)胞儀（FlowCytometry，F(xiàn)CM)分析Ha1-210-DEC205 與iDC的親和力；
[0013] ③體外T細(xì)胞增殖實驗：通過皮下注射Ηα1-210與完全弗氏佐劑 (completefreund'sadjuvant，CFA)的方案免疫Β6鼠構(gòu)建EAMG模型；無菌取EAMG鼠脾臟 和淋巴結(jié)，制備單細(xì)胞懸液，抗小鼠CD4抗體免疫磁珠分離T細(xì)胞，作為反應(yīng)細(xì)胞；分別加入 不同偶聯(lián)抗體與絲裂霉素C預(yù)處理的iDC共孵育體系，BrdU摻入法分析T細(xì)胞的增殖；
[0014] ④凋亡檢測：FITC-AnnexinV/PI染色分析T細(xì)胞的凋亡；
[0015]⑤細(xì)胞因子的檢測：ELISA檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ、TGF-a、IL-2、IL-4、IL-10等 相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。
[0016] 本發(fā)明的另一方面，還包括Ha1-210-DEC205偶聯(lián)抗體在體分析方法，包括以下 步驟：
[0017] ①體內(nèi)靶向iDC:將生物素標(biāo)記的不同偶聯(lián)抗體皮下注射EAMG動物模型，注射 后24h，無菌取小鼠腹股溝淋巴結(jié)，制作冰凍切片，Avidin-PE(red)染色，同時結(jié)合FITC 標(biāo)記抗⑶11c、抗B220、以及抗⑶3的抗體染色（green)，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 Ha1-210-DEC205偶聯(lián)抗體對iDC的靶向性；
[0018] ②EAMG病情影響：偶聯(lián)抗體同上治療4周后評估EAMG癥狀的變化；ELISA法檢測 血清抗AchR抗體水平；
[0019] ③免疫耐受檢測：取引流淋巴結(jié)體外培養(yǎng)，抗CD11C抗體免疫磁珠分離DC并鑒定 其表型；抗CD4抗體分離T細(xì)胞并分別給予相關(guān)刺激后觀察AchR特異性T細(xì)胞免疫耐受； 培養(yǎng)細(xì)胞以⑶4、⑶25抗體標(biāo)記后，F(xiàn)CM分析Treg細(xì)胞的含量；
[0020] ④長期治療作用觀察：偶聯(lián)抗體同上作用后繼續(xù)飼養(yǎng)EAMG小鼠2月，觀察其長期 治療作用、測定AchR抗體水平、觀察神經(jīng)肌接頭超微結(jié)構(gòu)變化。
[0021] 本發(fā)明的另一方面，還包括Ha1-210-DEC205偶聯(lián)抗體在自身免疫性疾病的治療 上的應(yīng)用。
[0022] 優(yōu)選的，還包括Ha1-210-DEC205偶聯(lián)抗體在MG治療上的應(yīng)用，可體內(nèi)靶向iDC， 誘導(dǎo)AchR特異性免疫耐受的形成。
[0023] 本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：本發(fā)明通過化學(xué)的方法將Ηα1-210與DC表面 特異性受體-DEC205單克隆抗體偶聯(lián)，合成Ηa1-210-DEC205偶聯(lián)抗體，體內(nèi)靶向iDC，使其 有效攝取、遞呈抗原給AchR特異性T細(xì)胞，在與T細(xì)胞相互作用時通過使T細(xì)胞發(fā)生無能、 凋亡或激活調(diào)節(jié)T細(xì)胞以及表型轉(zhuǎn)移等機制誘導(dǎo)AchR特異性免疫耐受的形成。
【附圖說明】
[0024] 圖1是重組載體pET16b_Hα1-210構(gòu)建。
[0025] 圖2是蛋白純化的SDS-PAGE分析
[0026] 圖3是ELISA檢測Ηα1-210蛋白的活性
[0027] 圖4是C57BL/6小鼠EAMG癥狀的評估
[0028] 圖5是EAMG大鼠血清抗體水平測定
[0029] 圖6是DC掃描電鏡圖像
[0030] 圖7是FCM分析、DC表型鑒定
[0031] 圖8是EAMG小鼠血清中anti-R97-116IgG水平。
[0032] 圖9是EAMG小鼠血清中anti-AChRα亞基IgG水平。
【具體實施方式】
[0033] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細(xì)說明。
[0034] 本發(fā)明的一種偶聯(lián)抗體的合成，包括以下步驟：
[0035] (1)基因克隆：培養(yǎng)表達(dá)人AchR的細(xì)胞系TE671，Trizol提取細(xì)胞總mRNA， Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，PCR擴增AchRa1亞單位胞外段（Ηα1-210)基因片 段上游引物：5'GCGCATATGTCCGAACATGAGACCCGTCT3'，下游引物：5'ATCGGATC ￡TCCAGGCGCTACATGACGAAGT3'（下劃線分別為Ndel和BamHI的酶切位點）。
[0036] (2)載體構(gòu)建：將上述基因片段和pET16b原核表達(dá)載體以Ndel和BamHI酶切后， 按照載體：片段~1:5的比例，使用T4DNA連接酶于16°C過夜連接目的片段與載體。將 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α菌株，挑取陽性菌落培養(yǎng)后，取菌液小提質(zhì)粒，Ndel和BamHI雙酶切及 測序鑒定片段正確。
[0037] (3)Ηα1-210蛋白表達(dá)、鑒定和純化：選取鑒定正確的如圖1所示的重組載體 pET16b-Ha1-210,轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)pLysS感受態(tài)菌，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100mg/L氯霉素 (Cam)、100mg/L氨芐青霉素（Amp)雙抗的2XYT瓊脂平板上，倒置平皿37°C孵育10h;隨機 挑取5個陽性轉(zhuǎn)化子接種于5mL含100mg/LCam和100mg/LAmp的2XYT培養(yǎng)液，于37°C、 240rpm(振搖直徑200mm)培養(yǎng)至0D值為0. 6,加入IPTG37°C誘導(dǎo)4h。誘導(dǎo)前后菌液分別 離心后冰浴超聲裂菌。如圖2所示，裂菌后上清及沉淀分別制樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，觀察 目的蛋白是否誘導(dǎo)表達(dá)；Ni2+親和層析柱純化表達(dá)的蛋白，SDS-PAGE進(jìn)一步鑒定Ηα1-210 蛋白的表達(dá)，并用Bradf