一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 芽孢桿菌（Bacillusspp.)廣泛存在于自然界的一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。該菌通過(guò) 分泌抗生素、抗菌蛋白和多肽類等多種抗菌活性物質(zhì)殺死植物病原物，減少后者對(duì)植物的 為害。芽孢桿菌易于繁殖，對(duì)不良環(huán)境具有很強(qiáng)的抵抗力，非常適合生物制劑的開(kāi)發(fā)、儲(chǔ)存 和應(yīng)用，但同時(shí)也因其發(fā)酵液富含養(yǎng)分，儲(chǔ)存不當(dāng)容易污染，且要保證其具有活性。因此，與 化學(xué)農(nóng)藥相比，生物菌劑的劑型研制相對(duì)困難。
[0003] 解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens，BA)是目前農(nóng)業(yè)部令（2008年 1126號(hào)）酶制劑類飼料添加劑所允許使用的益生菌種類，但該菌在農(nóng)業(yè)部令動(dòng)物微生物飼 料添加劑欄目中尚未列出。
[0004] 同時(shí)目前，芽孢桿菌菌劑主要有可濕性粉劑、乳劑、懸浮劑劑型，但不同的芽孢桿 菌菌株間產(chǎn)孢率、芽孢存活率以及對(duì)助劑的敏感性不同，針對(duì)特定的菌株，因此需要適合的 劑型非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
[0007] -種解淀粉芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensGB1菌株于 2015年8月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏號(hào) 為CGMCCNo. 11250。
[0008] 所述解淀粉芽孢桿菌特異性堿基序列為SEQIDNo. 2-15所示。
[0009] 所述解淀粉芽孢桿菌特異性堿基序列可作為檢測(cè)解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensGB1 的標(biāo)記物。
[0010] 一種檢測(cè)解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensGB1的標(biāo)記物，標(biāo)記物為 SEQIDNo. 1-14序列中一個(gè)或幾個(gè)序列。
[0011] -種解淀粉芽孢桿菌在防治病原真菌引起的病害中的應(yīng)用。
[0012] -種解淀粉芽孢桿菌作為用于制備植物促生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用
[0013] -種生物制劑，生物制劑中含所述的解淀粉芽孢桿菌GB1。
[0014] 所述生物制劑劑型為可分散液劑、水乳劑、水懸浮劑、乳油、微乳劑、水分散粒劑或 可濕性粉劑；所述劑型配制可按照現(xiàn)有技術(shù)記載的內(nèi)容完成。
[0015] -種生物制劑在防治病原真菌引起的病害中的應(yīng)用。
[0016] -種生物制劑作為用于制備植物促生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用
[0017] 本發(fā)明所具有優(yōu)點(diǎn)：
[0018] 本發(fā)明所獲得的解淀粉芽孢桿菌GB1，分離自黃瓜老莖，該菌株具有的廣譜抑菌作 用，其是，能夠高效抑制病原真菌分生孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)，并定植于傷口形成生物膜，有效 阻止病原真菌對(duì)其的侵染，抑制植物病原菌以及其他有害微生物的侵染繁殖，并且具有促 進(jìn)植物生長(zhǎng)的機(jī)制，產(chǎn)生植物激素促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而增加產(chǎn)量。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的解淀粉芽孢桿菌GB1在LB培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀圖。
[0020] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的解淀粉芽孢桿菌GB1基因組DNA圈狀圖。
[0021] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的解淀粉芽孢桿菌GB1對(duì)一些植物病原菌的平板抑制效 果圖。其中，A:蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌；B:蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌；C:蘋(píng)果炭疽葉枯病菌；D:蘋(píng)果輪紋 病菌；E:蘋(píng)果炭疽病菌；F:葡萄炭疽病菌。
[0022] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的解淀粉芽孢桿菌GB1抑制蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌生長(zhǎng)發(fā)育圖 片。其中，A1 :蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌正常菌絲，A2-A6 :GB1對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌絲的裂解作用； B1:蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌孢子萌發(fā)正常，B2:蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌孢子受到GB1強(qiáng)烈抑制，不能萌發(fā)。
[0023]圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的解淀粉芽孢桿菌GB1定殖于蘋(píng)果樹(shù)枝條傷口形成生物 膜圖。其中，左圖，GB1定殖于蘋(píng)果樹(shù)枝條木質(zhì)部；右圖，GB1定殖于蘋(píng)果樹(shù)枝條韌皮部，并 在傷口愈合處形成生物膜。
[0024]圖6為本發(fā)明實(shí)施例提供的解淀粉芽孢桿菌GB1加速蘋(píng)果樹(shù)枝條傷口的愈合。其 中A為生防菌株GB1的發(fā)酵液涂抹的傷口愈合圖，B為涂抹40%福美砷可濕性粉劑50倍液 的傷口愈合圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖并通過(guò)【具體實(shí)施方式】來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 解淀粉芽抱桿菌BacillusamyloliquefaciensGB1菌株的篩選：
[0028] 材料：所采用的樣品為黃瓜品種一一津雜3號(hào)的老莖。
[0029] 所用的培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl10g，調(diào)pH至7.0， 用去離子水定容至1L)。
[0030] 篩選過(guò)程：用無(wú)菌水沖洗黃瓜老莖，晾干后切成約1cm長(zhǎng)的小段，浸泡于75%酒 精中2min，再用無(wú)菌生理鹽水（0.9%NaCl)徹底清洗組織（小段）3次，將組織轉(zhuǎn)移到 無(wú)菌的研缽中磨碎后轉(zhuǎn)移到裝有15mL離心管中，水?。?0°C) 10分鐘。將管中的漿液梯 度稀釋后，取100μL的培養(yǎng)液涂布于LB平板上，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，選取平板上菌 落形態(tài)不同的單個(gè)菌落。經(jīng)平板對(duì)持試驗(yàn)，抑菌效果最好的為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensGB1 菌株。
[0031] 所述解淀粉芽抱桿菌BacillusamyloliquefaciensGB1，該菌株于2015年8月 18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No. 11250,保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編 100101。
[0032] 菌落形態(tài)特征：菌株GB1菌體呈短桿狀，具運(yùn)動(dòng)性，兼性厭氧，染色均勻，可形成內(nèi) 生芽孢，芽孢囊膨大，呈橢圓形，游離芽孢表面著色弱，革蘭氏染色陽(yáng)性。在LB培養(yǎng)基上呈 白色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規(guī)則（參見(jiàn)圖1)。
[0033] 培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：GB1在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較快，溫度為15~45°C間都 能生長(zhǎng)，但在30~40°C時(shí)最適于生長(zhǎng)，pH5~9,足夠的通氣條件有利于菌體繁殖，當(dāng)培養(yǎng) 基的pH值低于4或高于10時(shí)，則生長(zhǎng)緩慢。
[0034]鑒定：16SrDNA序列，DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞基基因（gyrasesubunitA)，（gyrA)序列 和組氨酸合成酶（cheA)基因序列，及基因組序列用于GB1種類的鑒定。GB1的16SrDNA， GyrA和CheA基因序列（GenBank登記號(hào)分別為KP337613,KP337615和KP337614)顯示，與 解淀粉芽孢桿菌相似度達(dá)99%以上?；蚪MDNA的聚類結(jié)果表明，其與解淀粉芽孢桿菌聚 在一支（clade)〇
[0035] 同時(shí)，通過(guò)IlluminaHiseq2000平臺(tái)測(cè)序，樣品GB1共產(chǎn)出679Mb數(shù)據(jù)?；跍y(cè) 序數(shù)據(jù)組裝得到樣品GB1基因組大小為4, 014, 477bp，GC含量46. 43%，共4個(gè)scaffold， 6個(gè)contig?；蚪M組分分析后發(fā)現(xiàn)，樣品GB1的基因組含有4, 011個(gè)基因，總長(zhǎng)度為 3, 572, 685bp，平均長(zhǎng)度891bp，占基因組全長(zhǎng)的89. 00%。串聯(lián)重復(fù)序列共139個(gè)，總長(zhǎng)為 9, 058bp，占基因組全長(zhǎng)的0.2256%。小衛(wèi)星序列114個(gè)，微衛(wèi)星序列7個(gè)。tRNA85個(gè)， rRNA27個(gè)（參見(jiàn)圖2)。
[0036] 并且，通過(guò)相應(yīng)的同源性比對(duì)，本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌GB1具有14個(gè)特異性基因 核苷酸序列，分別如SEQIDNo. 1-14所示：
[0037]SEQIDNo. 1--GB1_00345
[0038]ATGATCATTAAAATGACTCCATTTAATATGAAAGAATTCAATAAACCAAACAACCATTTGCTGTTTCAG GGAGAATTGCACCTGCATTTGAAAACAATGTGTGGAATATACCGAGGAACGATTTGCTGA
[0039]SEQIDNo. 2--GB1_00389
[0040]ATGAAGATCAGCCGGACTTTGTTTTCAGTCATTTTATTGGGTAGCATCGCAGGAGTAATTTTAACAAAT GATGCCCCTGTTATCAAAGCTCCTTTCCATGTTGCTGACGACAGAGTAGGTGCTTAG
[0041]SEQIDNo. 3--GB1_02087
[0042]ATGTGGATGATCATTTTGCTGCTTATCATTTTAATCGGTTTTACCGGTAATATCATCTCGCTTTTGAGA GCGCAAAGACACGCATCTCAAAGAATAATTGAGCTTTTAGAAAAGCAAAGCCGAAAATAA
[0043]SEQIDNo. 4 --GB1_02122
[0044]ATGCGCAAAGAACAAGACCGTTACATCTATGATGAAAAAGAAAGTGAAGAAACGGCCAGGCTCATCTCA GAGGCATACGAAAGCGGTTATGTCGGCATGGAGGAAGCCTCTGCTCCTTCAGAAAATTAA
[0045]SEQIDNo. 5--GB1_02233
[0046]GTGGACAACAAAGAATTTGGATACGTTAGTGTAAGTAGCAAAGACCAAAATGAAGCACGACAACTGG ATAGTATGTATGCTCTTGGAATTGATGAGCGTGATATTCATATCGATAACAAAGCGGGAAAGACTTCAATAGACC TCAATACCAAGCTTTGA
[0047]SEQIDNo. 6--GB1_02325
[0048