構建鏈特異性轉錄組文庫的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種構建鏈特異性轉錄組文庫的方法。
【背景技術】
[0002] 轉錄組二代測序作為近年來新發(fā)展起來的高通量測序技術，為大規(guī)模轉錄組學研 究提供了一種全新的且更為有效的方法。該技術能在單核苷酸水平上全面快速地獲取某一 物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉錄本。與其他轉錄組學技術相比，其具有 高通量、低成本、高靈敏度等明顯的優(yōu)勢，同時可以獲得低豐度的表達基因。
[0003] 目前各大生物公司及文獻報道了多種文庫構建的方法：從起初需全長mRNA進行 建庫到目前采用片段化處理mRNA再進行建庫，極大降低了全長mRNA建庫帶來的末端偏好 性及合成全長cDNA引入的錯誤等問題，提高了文庫的均一性及后續(xù)數據分析的效率。當前 市場上主要存在兩種方法：第一種方法一也是目前最普遍米用的方案，先合成雙鏈cDNA， 然后經末端修飾、連接測序接頭、PCR擴增即得到轉錄組PE(pairend)文庫。第二種方法， 鏈特異性建庫或方向性建庫，是通過反轉錄將P7測序接頭序列引入到cDNA第一鏈。與第 一種建庫方法相比較，后者優(yōu)勢明顯，主要表現在：1)建庫周期大大縮短，僅僅一天就可以 完成文庫構建；避免了合成cDNA第二鏈而引入的錯誤信息；2)可以確定兩條鏈的轉錄方向 性（正義或反義鏈），為基因的進一步注釋和功能分析提供更準確的信息；3)可以挖掘轉錄 組中的non-codingRNA信息及反義（antisense)轉錄本；4)還可以進行基因結構的研究， 例如原核生物操縱子鑒定，為基因網絡調控的研究提供有力支持。但目前該鏈特異性建庫 存在一些缺陷，如cDNA合成效率低、副產物多等。
[0004] 鏈特異性建庫如Epicentre公司的ScriptSeq?v2RNA-Seq法（如圖1所示）是 通過末端延伸的方法，將測序接頭序列引入到cDNA兩端，最后通過PCR擴增得到含有P5/P7 測序接頭序列的鏈特異性文庫，具體為：1)mRNA片段化處理：在fragmentbuffer作用下， 85度加熱處理，得到目標片段大小主要集中在300bp左右的RNA;2)反轉錄：采用R6N進行 反轉錄，合成cDNA第一鏈；3)cDNA3'端標記：去除RNA后，采用F6N與cDNA3'端進行退火 配對，在聚合酶作用下對cDNA進行延伸；4)PCR擴增：采用含不同標簽的引物進行擴增（一 次性可以處理多個樣本），產物經磁珠純化后即得到鏈特異性轉錄組文庫；5)質檢：電泳檢 測及Agilent2100檢測文庫大小及質量。
[0005]v2RNA-Seq法缺陷如下：1)cDNA第一鏈合成效率低：采用隨機堿基引物進行反轉 錄，引物與模板mRNA隨機進行匹配退火，導致cDNA第一鏈長度差異很大，產生較多的短片 段，并且因偏好性問題導致cDNA不均一，造成cDNA合成效率低，最終影響文庫的質量，不 利于后續(xù)數據的分析。2)副產物影響：采用R6N/F6N末端都是隨機堿基，極易形成自連產 物，降低了文庫構建的效率，影響文庫質量，甚至導致文庫構建失敗，造成后續(xù)數據分析的 困難。3)cDNA3'端標記效率低：用于延伸的引物F6N的3'末端6個N堿基后直接采用C3 spacer處理，因空間位阻，會影響6N與cDNA末端退火配對，并且極易互相配對，降低了反應 中F6N的有效濃度，最終影響cDNA3'端延伸。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明針對現有技術v2RNA-Seq法中的cDNA3'端標記效率低的技術問題，目的 在于提供一種新的構建鏈特異性轉錄組文庫的方法。在該方法中，cDNA第一鏈合成后，采用 TdT末端轉移酶在cDNA3'端添加多個dC堿基（即同聚物dCTP)及ddCTP進行末端封閉終 止反應，然后與含多個dG堿基的F5G引物（即帶5個G的第二鏈合成引物）配對，在聚合 酶的作用下進行cDNA二鏈合成，通過延伸固定堿基序列克服了原有步驟的缺陷，極大程度 的提高了末端延伸的效率，降低偏好性及自連產物的產生，從而提高cDNA3'端標記效率。
[0007] 本發(fā)明的構建鏈特異性轉錄組文庫的方法如下步驟：
[0008] 步驟1)mRNA片段化處理；
[0009] 步驟2)反轉錄：合成cDNA第一鏈；
[0010] 步驟3)cDNA3'端標記：去除RNA后，采用TdT末端轉移酶對cDNA3'端添加多個 dC堿基，并采用ddCTP進行末端封閉終止反應，然后與帶5個G的第二鏈合成引物（簡稱 F5G引物）進行配對，在聚合酶作用下復制cDNA第一鏈；
[0011] 步驟4)PCR擴增。
[0012] 為了解決現有技術中cDNA第一鏈合成效率低的技術問題，本發(fā)明的構建鏈特異 性轉錄組文庫的方法在步驟2)反轉錄之前，片段化的mRNA3'端連接已知序列的R3接頭； 在步驟2)反轉錄中：再采用cDNA逆轉錄引物（簡稱RTprimer)與R3接頭退火配對進行 反轉錄，合成cDNA第一鏈，如此可有效減少了短片段產生，提高了cDNA均一性，從而顯著地 提高cDNA第一鏈合成效率。
[0013] 在本發(fā)明一較佳實施例中，在步驟2)反轉錄之前，每1μg片段化的mRNA3'端連 接5~12pmol優(yōu)選8~lOpmol已知序列的R3接頭；步驟2)反轉錄：采用25~60pmol優(yōu) 選40~50pmolRTprimer與R3接頭退火配對進行反轉錄，合成cDNA第一鏈。
[0014] 在本發(fā)明另一較佳實施例中，步驟3)cDNA3'端標記：去除RNA后，針對lyg片段 化的mRNA3'，cDNA合成后采用30~50U優(yōu)選40UTdT對cDNA3'端添加多個dC堿基，并 米用4~6nmol優(yōu)選5nmolddCTP進行末端封閉，然后與80~120pmol優(yōu)選lOOpmolF5G 引物進行配對，在聚合酶作用下復制cDNA第一鏈。
[0015] 本發(fā)明為了解決現有技術中極易形成自連產物的技術問題，較佳地是，去除RNA 后，先用50pmol的封閉引物（簡稱Cover-Primer)對剩余的RTPrimer進行封閉，再用TdT 對cDNA3'端添加多個dC堿基，如此極大地降低了自連二聚體的產生。
[0016] 步驟 1)每 1μg的mRNA用 30 ~50μL的Dynabeadsoligo(dT) 25 (即寡聚脫氧腺 苷酸磁珠）進行富集后再進行片段化處理。
[0017] 步驟4)PCR擴增：采用含不同標簽的引物進行擴增，產物經磁珠純化后即得到鏈 特異性轉錄組文庫。
[0018] 本發(fā)明的構建鏈特異性轉錄組文庫的方法還可包括步驟5)質檢：用0.6~1倍優(yōu) 選0. 8倍體積的Ampure磁珠純化回收目的區(qū)域片段，然后采用8%PAGE膠或1 %瓊脂糖凝 膠電泳及Agilent2100檢測文庫大小及質量。
[0019] 在本發(fā)明中，所述的Cover-Primer的序列為AAANNNNNNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGGA ACTC-C3Spacer。所述的F5G引物的序列為CTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGGGH;所述R3 接頭 的序列為TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG;所述的RTprimer的序列為GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA。
[0020] 在本發(fā)明中，術語"TdT"是指末端轉移酶；術語"ddCTP"是指雙脫氧胞嘧啶；術語 "F5G"也稱"Trans-F5G"是指帶5個G的第二鏈合成引物；術語"RTprimer"是指cDNA逆 轉錄引物；術語"R3接頭"是指連接到mRNA3'端的接頭；術語"Cover-Primer"是指封閉引 物，即封閉多余R3接頭序列的引物。
[0021] 本發(fā)明的積極進步效果在于：如圖2所示為本發(fā)明的構建鏈特異性轉錄組文庫的 示意圖，將測序接頭序列（如R3接頭）直接連接到RNA的3端引入到引物序列中，通過反 轉錄及末端標記含多個dC堿基，通過含多個G的第二鏈引物，實現DNA兩端分別含有測序 接頭序列，最終通過PCR擴增得到鏈特異性文庫。并在此基礎上進行了優(yōu)化：在cDNA合成 完成后，采用Cover-Primer封閉剩余的RTprimer，減少自連二聚體的產生；mRNA先連接R3 接頭再進行cDNA合成，以提高cDNA合成效率、cDNA均一性；三種方案可以有效降低接頭二 聚體的產生、提高文庫均一性及文庫質量，便于后續(xù)的數據分析。
【附圖說明】
[0022] 圖1為現有技術中ScriptSeq?v2RNA-Seq法構建文庫的示意圖。
[0023]圖2為本發(fā)明的構建鏈特異性轉錄組文庫的示意圖。
[0024] 圖3為實施例1和對比實施例1獲得的目的區(qū)域片段用1%瓊脂糖凝膠電泳的結 果圖。
[0025] 圖4為實施例1和實施例3獲得的目的區(qū)域片段用1%瓊脂糖膠電泳的結果圖。
【具體實施方式】
[0026] 實施例1
[0027]mRNA片段化處理：提取合格的RNA，采用life-tech公司的Dynabead soligo(dT) 2550μL與 1μg總RNA混合純化mRNA。取 7yL5X(即 5 倍）fragmentbuffer 加入到28yLmRNA中，94°C5min，然后立即冰上。加入65yLddH20(即雙蒸水）、20yg糖 元、1/10體積3MpH5. 2NaAc、2. 5倍體積無水乙醇，混勾，存放-80°C20min;高速離心，沉淀 溶解于13μL去離子水。
[0028] 連接R3 接頭：mRNA溶解于 5μLddH20 中，加入 1μL10μΜ的R3 接頭，70°C2min， 冰上lmin。加入 1.5yLligationMix、200UT4截短型RNA連接酶 2K227Q(T4RNAligase 2TruncatedK227Q)，ddH20 補至 15μL，混勻，22°Clh。
[0029]cDNA合成：加入 1μL50μM的RTprimer，65°C5min，冰上放置lmin;加入 4μL RTMix、20UMMLV逆轉錄酶、ddH20補至 20yL，混勻，然后 25°C10min，42°C40min，4°C保存。
[0030]cDNA末端標記：加入 20mgRNaseA，37°C15min，降解RNA/DNA雜合體的RNA。加 入 2yL50μΜCover-Primer;65°C5min，緩慢降溫至 20°C。加入 2.5yL10X末端轉移 Buffer、0.5yLlOmMdCTP、40UTdT，ddH20 補至 25yL，37°C30min。加入 0.5yLlOmM ddCTP，37°C15min;磁珠純化，20yLpH= 8.0TE(10mMTris-HCl和ImMEDTA)洗脫。加 入 1μL100μM的F5G，65°C2min，冰上lmin;加入 3μLKlenowfragment酶緩沖液、lul dNTP(lOmM)，0· 5μLKlenowfragment(10U/μL)(大腸桿菌DNA聚合酶I大片段），ddH20 補充至30yL，37°C60min。采用1.8倍體積Ampure磁珠進行純化DNA，30yLTE洗脫。
[0031]PCR擴增：上述純化的DNA14yL、正向引物0.5yL、反向引物0.5yL、2XPCR聚 合酶混合液 12yL混勻后，94°C5min、94°C10s、62°C15s、72°C30s，共 15 個循環(huán)，4°C保存。
[0032] 采用0. 8倍體積Ampure磁珠純化回收目的區(qū)域片段，并采用8%PAGE膠或1%瓊 脂糖凝膠電泳和Agilent2100檢測。
[0033] 實施例2
[0034]mRNA片段化處理：提取合格的RNA，采用life-tech公司的Dynabeadso 1igo(dT) 2530μL與