一種人工合成的抗蟲(chóng)基因表達(dá)載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人工合成的抗蟲(chóng)基因表達(dá)載體及其應(yīng)用，特別涉及一種根據(jù)玉米 偏好密碼子設(shè)計(jì)并合成的抗蟲(chóng)基因表達(dá)載體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前在植物轉(zhuǎn)基因育種中所應(yīng)用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多來(lái)自原核生物， 由于原核生物基因自身的特點(diǎn)，如1)AT含量較高，超過(guò)60%，造成基因表達(dá)的mRNA在植物 體內(nèi)極易被降解；2)存在類(lèi)似真核基因的內(nèi)含子切點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子序列，造成轉(zhuǎn)錄不完整、 mRNA異常剪切等；3)密碼子與植物密碼子存在較大差異，造成蛋白翻譯效率降低；4)其結(jié) 構(gòu)與植物等真核生物差異顯著，如不含有真核生物基因的5' -UTR序列和3'末端的polyA 加尾序列，導(dǎo)致基因在植物體內(nèi)往往表達(dá)水平較低。例如，來(lái)自于蘇云金芽孢桿菌的野生型 殺蟲(chóng)蛋白基因在植物中的表達(dá)量非常低，其表達(dá)的毒蛋白只占總蛋白的0.001%或者幾乎 檢測(cè)不到。
[0003] 玉米螟是世界性的主要玉米害蟲(chóng)，每年因玉米螟危害造成玉米產(chǎn)量損失在5%左 右。我國(guó)是玉米螟的多發(fā)和重發(fā)區(qū)，20世紀(jì)70年代以來(lái)，幾乎每?jī)赡昃痛蟀l(fā)生一次，年損失 玉米380-640萬(wàn)噸，相當(dāng)于一個(gè)中等玉米省的產(chǎn)量。
[0004] 由于玉米的內(nèi)源抗蟲(chóng)性是受多基因控制的，且心葉期靶標(biāo)害蟲(chóng)和穗期靶標(biāo)害蟲(chóng)基 因各自獨(dú)立遺傳，用常規(guī)育種方法培育抗螟雜交種不僅周期長(zhǎng)，而且很難獲得兼抗兩個(gè)世 代玉米螟的親本。同時(shí)，玉米抗螟基因很有可能與高產(chǎn)性狀呈負(fù)相關(guān)，20年來(lái)各國(guó)抗螟育種 均未取得明顯進(jìn)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)載體。
[0006] 本發(fā)明所提供的表達(dá)載體為表達(dá)人工合成的抗蟲(chóng)基因的表達(dá)載體；所述人工合成 的抗蟲(chóng)基因（命名為mCrylAh)為下述a)或b)或c)的DNA分子：
[0007]a)核苷酸序列如序列表中序列3所示；
[0008] b)核苷酸序列如序列表中序列3的第1-2007位所示；
[0009] C)核苷酸序列與序列表中序列3或序列3的第1-2007位至少具有98%的同一性， 且編碼序列9所示蛋白質(zhì)（命名為CrylAh蛋白）。
[0010] 可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異的啟 動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。如花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S;西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子（PIN2)或LAP啟動(dòng)子（均可用茉莉酮酸曱酯誘導(dǎo)）；熱休克啟動(dòng)子；四環(huán)素誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子；種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子PF128,種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng) 子，例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆betaconglycin的啟動(dòng)子等。
[0011] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)載體中啟動(dòng)所述人工合成的抗蟲(chóng)基因的啟動(dòng) 子具體為Ubi啟動(dòng)子，其核苷酸序列為序列表中序列6,或與序列6至少具有80 %的同一 性，且具有啟動(dòng)子功能。
[0012] 可用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子（N0S終 止子）、花挪菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、婉?rbcSE9終止子和胭脂氨酸和 章魚(yú)氨酸合酶終止子。
[0013] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)載體中終止所述人工合成的抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)錄的 轉(zhuǎn)錄終止序列具體如序列表中序列7所不，或與序列7至少具有80%的同一性，且具有轉(zhuǎn)錄 終止功能的序列。
[0014] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)載體中還包括0ΜΚ序列；所述0ΜΚ序列由Ω 序列和Kozak序列順次連接組成，其序列具體如序列表中序列5所示，或與序列5至少具有 80%的同一性，且具有增強(qiáng)子功能。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)載體（命名為PS3300-UMG2-UC2A)的序列為 序列表中序列11。
[0016] 其中，序列3由2010個(gè)核苷酸組成，其末尾處為兩個(gè)終止密碼子，編碼序列表中 序列9所示的CrylAh蛋白。序列5由67個(gè)核苷酸組成。序列6由2009個(gè)核苷酸組成。 序列7由488個(gè)核苷酸組成。序列9由668個(gè)氨基酸組成。序列11由15099個(gè)核苷酸組 成，其中第151-2159位為Ubi啟動(dòng)子序列，第2160-2226位為0ΜΚ序列，第2233-4242位為 mCyrlAh序列，第4268-4755位為轉(zhuǎn)錄終止序列。
[0017] 含有所述表達(dá)載體的重組細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因微生物也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0018] 所述重組細(xì)胞系可以為真核細(xì)胞，也可以為原核細(xì)胞，如植物細(xì)胞系。在本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)基因植物（如玉米）包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。所述轉(zhuǎn) 基因微生物為轉(zhuǎn)入所述重組DNA片段的農(nóng)桿菌LBA4404。
[0019] 所述表達(dá)載體在培育抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述轉(zhuǎn) 基因玉米包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。
[0020] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述玉米具體為玉米HiII。
[0021] 在本發(fā)明中，所述抗蟲(chóng)具體為抗玉米螟。
[0022] 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明所提供的人工合成的抗蟲(chóng)基因（序列3)的轉(zhuǎn)基因玉米，其 CrylAh蛋白蛋白的表達(dá)量明顯提尚，每克（鮮重）葉片中CrylAh蛋白的表達(dá)量可達(dá) 3. 18μg，而原始基因表達(dá)量?jī)H為1.01μg。同時(shí)，本發(fā)明所提供的人工合成的抗蟲(chóng)基因（序 列3)的轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)革巴標(biāo)害蟲(chóng)的抗性也明顯提高，轉(zhuǎn)入mcrylAh基因的T6代植株，在玉米 5-6葉期接蟲(chóng)后，無(wú)明顯的蟲(chóng)害，表現(xiàn)正常；而轉(zhuǎn)crylAh基因（優(yōu)化前，序列2)及非轉(zhuǎn)基因 植株，在接蟲(chóng)后，蟲(chóng)害非常嚴(yán)重。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖 1 為載體pS3300-UMCT-UMG2、pS3300-UMG2-UCA和pS3300-UMG2-UC2A的質(zhì)粒 圖譜。其中，A為pS3300-UMCT-UMG2的質(zhì)粒圖譜；B為pS3300-UMG2-UCA的質(zhì)粒圖譜；C為 PS3300-UMG2-UC2A的質(zhì)粒圖譜。
[0024] 圖2為轉(zhuǎn)基因玉米CrylAh基因、mCrylAh基因和mG2-aroA基因的PCR檢測(cè)圖譜。 其中，A為轉(zhuǎn)基因玉米CrylAh基因的PCR檢測(cè)圖譜；1 :CK+(質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照）；2:Marker;3 : CK(未加DNA) ;4:CK(非轉(zhuǎn)基因玉米）；5-24 :轉(zhuǎn)CrylAh基因玉米事件。B為轉(zhuǎn)基因玉米mCrylAh基因的PCR檢測(cè)圖譜；1 :CK+(質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照）；2:Marker;3:CK(未加DNA) ;4 : CK(非轉(zhuǎn)基因玉米）；5-24:轉(zhuǎn)mCrylAh基因玉米事件。C為轉(zhuǎn)基因玉米mG2-aroA基因的 PCR檢測(cè)圖譜；1 :CK+(質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照）；2:Marker;3:CK(未加DNA) ;4:CK(非轉(zhuǎn)基因玉 米）；5_14 :轉(zhuǎn)CrylAh基因玉米事件；15-24 :轉(zhuǎn)mCrylAh基因玉米事件。
[0025]圖3為轉(zhuǎn)基因玉米苗期草甘膦的耐受性檢測(cè)結(jié)果。
[0026] 圖4為轉(zhuǎn)基因玉米田間抗蟲(chóng)性檢測(cè)結(jié)果。其中，A為海南抗蟲(chóng)的轉(zhuǎn)mCrylAh基因 玉米株系；B為海南不抗蟲(chóng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗怠?br>【具體實(shí)施方式】
[0027] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0028] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0029] 實(shí)施例1、密碼子優(yōu)化型抗蟲(chóng)基因的獲得
[0030] 本實(shí)施例根據(jù)CrylAh全長(zhǎng)基因（核苷酸序列如序列表中序列1所示，參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān) 利申請(qǐng)：200410009918. 9)編碼蛋白的前667個(gè)氨基酸序列（前667個(gè)氨基酸序列如序列 表中序列8所示，對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如序列表中序列2所示），在保證氨基酸序列不變的前 提下，首先采用玉米偏好密碼子對(duì)CrylAh基因進(jìn)行人工優(yōu)化改造。盡量避免使用玉米稀有 密碼子，并調(diào)整了密碼子的使用頻率（表1)。在此基礎(chǔ)上，去除DNA序列中存在的典型的 造成植物基因轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定的富含AT序列，并去除了發(fā)夾結(jié)構(gòu)，得到的新的核苷酸序列為 序列表中序列3。序列3與CrylAh基因（序列1)的l-2001bp(即序列2)的同源性只有 70%，而G+C含量由原來(lái)的37. 4%增加到56. 3%。同時(shí)為了便于克隆，在起始密碼子后添 加GGC三個(gè)核苷酸。序列3所示基因即為密碼子優(yōu)化型抗蟲(chóng)基因，將其命名為mcrylAh。密 碼子在CrylAh基因和mcrylAh基因中的使用頻率見(jiàn)表1。為方便克隆，發(fā)明人在序列3的 5'端引入Spel酶切位點(diǎn)，在3'端引入Aatll酶切位點(diǎn)，最終序列如序列表中序列4所示。 序列4的第7-2016位即為序列3。序列1的第1-2001位（即序列2)編碼序列表中序列8 所不蛋白，序列3以及序列4的第7-2016位均編碼序列9所不蛋白（與序列8所不蛋白相 比多出序列9自N端起的第2個(gè)氨基酸殘基），將該蛋白命名為CrylAh蛋白。
[0031] 表1玉米優(yōu)選密碼子標(biāo)準(zhǔn)
[0032]
[0033]
[0034]
[0035]實(shí)施例2、mcry 1 Ah轉(zhuǎn)基因玉米的獲得
[0036] 一、重組表達(dá)載體pS3300-UMG2-UCA和pS3300-UMG2-UC2A的構(gòu)建
[0037] 為了提高mcrylAh基因（序列3)在受體生物中的表達(dá)水平，發(fā)明人在構(gòu)建 mcrylAh基因的重組表達(dá)載體時(shí)，在mcrylAh基因的5'端添加了Ω序列和Kozak序列，Ω/ Kozak序列（簡(jiǎn)稱(chēng)0ΜΚ)如序列表中序列5所示。Ω序列是衍生于植物病毒衣殼蛋白基因 編碼區(qū)的翻譯增強(qiáng)序列，由67bp組成，富集TTAAC序列，5'端有一個(gè)UAUUUUUACAACAA序列 以及4個(gè)UUAC序列，這些序列在蛋白質(zhì)合成的翻譯過(guò)程中構(gòu)成核糖體和rRNA結(jié)合位點(diǎn)。 Kozak序列是促進(jìn)外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)翻譯過(guò)程的編碼核糖體結(jié)合蛋白的序列。啟動(dòng)子 選用組成性啟動(dòng)子Ubi啟動(dòng)子，其序列如序列表中序列6所示。再則，在編碼序列3'端設(shè)計(jì) 了2個(gè)連續(xù)的終止密碼子，以及加入人工合成的PolyA+T-NOS穩(wěn)定終止序列。PolyA+T-