檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)細菌性感染者腦脊液中病原菌的基因芯片及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是多位點基因檢測芯片，尤其是適用于 細菌性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體的快速診斷基因芯片集成檢測方法，在芯片上設置多種細 菌的探針，其中包括細菌性CNS感染腦脊液中一些常見病原菌，利用PCR擴增產(chǎn)物進行雜交 試驗檢測、鑒定測試樣本。
【背景技術(shù)】
[0002] 中樞神經(jīng)系統(tǒng)（centralnervoussystem,CNS)感染是神經(jīng)系統(tǒng)主要疾病譜之一， 臨床多表現(xiàn)為腦膜（腦）炎癥狀，如發(fā)熱、頭痛、嘔吐、意識障礙及腦膜刺激征等，病死率和 致殘率高，早期明確的病原學診斷是臨床正確抗感染治療的關(guān)鍵。引起CNS感染的病原微 生物種類很多，細菌性病原體是較常見之一。長期以來，臨床微生物實驗室用于診斷細菌 性CNS感染病原體的方法主要包括腦脊液涂片鏡檢與培養(yǎng)鑒定等表型方法、腦脊液免疫學 檢測方法及生物化學標志物檢測和聚合酶鏈反應（PCR)技術(shù)等，國內(nèi)外亦不斷有利用細菌 16SrRNA基因結(jié)構(gòu)特點構(gòu)建基因芯片來鑒定病原體的報道。
[0003] 腦脊液涂片鏡檢和培養(yǎng)等表型方法目前仍是各臨床實驗室診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感 染最常用的檢測手段，從中發(fā)現(xiàn)致病菌是判斷感染的"金標準"，但這些常規(guī)方法存在如下 不足：（1)由于實驗室檢測方法學原因?qū)е赂腥静≡w無法檢測或檢測周期過長，滯后于 臨床需求使確診困難而錯失早期或關(guān)鍵期的治療機遇：①腦脊液涂片顯微鏡檢查，檢出率 低，敏感性差；②腦脊液細菌培養(yǎng)所需時間長（2-5天）、培養(yǎng)陽性率低（約10-15%左右）； ③受抗生素使用和病原菌自身條件的限制、無法實現(xiàn)廣譜病原體的篩查和監(jiān)測。（2)由于病 原體無法或快速準確的分離鑒定，導致治療的盲目性，使耐藥菌增加并加重患者負擔：①目 前使用的全自動細菌鑒定儀在鑒定某些菌時可能出現(xiàn)差錯，鑒定準確性值得商榷；②混合 感染易誤診或漏診；③質(zhì)譜鑒定儀鑒定目前仍需先獲得陽性菌落，直接檢測鑒定病原體仍 需大量樣本來驗證；④商品化表型鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫有限，很難區(qū)分表型相近病原菌。
[0004] 腦脊液免疫學檢測方法（如鏈球菌乳膠凝集檢測）只能檢測特定病原體，不能檢 測腦脊液中未知細菌和對病原菌進行分類，存在假陽性率高等缺點。PCR檢測方法主要采用 熒光定量PCR技術(shù)和脫氧核糖核酸測序技術(shù)，前者的缺陷在于受限于熒光檢測通道數(shù)，目 前只能對一個或少數(shù)幾個細菌核酸同時檢測，通量低；后者操作復雜，不便于在檢驗科實驗 室常規(guī)開展，測序結(jié)果的判定亦存在一定錯誤的風險，需要多拷貝雙向測序。而目前眾多基 因芯片多以硝酸纖維膜和尼龍膜等不同載體和地高辛、膠體金顯色等方法制備或基于細菌 16SrRNA微型寡合苷酸芯片檢測腦脊液病原菌的研究，但存在致病菌覆蓋不全面、缺少大樣 本臨床驗證數(shù)據(jù)等不足，從而限制了其在臨床的應用。
[0005] 目前臨床微生物實驗室采用的傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)鑒定存在諸多客觀缺點，如依靠表型 鑒定、敏感性低、檢測周期長、易受抗生素應用等各方面的限制，鑒定準確性亦值得商榷，不 能滿足臨床快速診斷的要求。目前進行菌種分型的方法主要有聚合酶鏈式反應-限制性片 段長度多態(tài)性（PCR-RFLP)、測序、序列特異性引物PCR、熒光定量PCR等方法，不僅操作繁 瑣、檢測周期長、通量小，且檢測過程影響因素多、不易控制，不能同時對多種病原體進行分 型，難以滿足臨床檢驗的要求，使臨床至今無法開展中樞神經(jīng)感染細菌病原體的廣譜、集成 檢測。
[0006] 基因芯片是近幾年在高科技領(lǐng)域內(nèi)出現(xiàn)的最具時代特征的重大科技進展之一，其 主要原理是將能反映樣本中大量基因信息的基因探針（寡核苷酸探針、cDNA克隆、PCR產(chǎn)物 等）以一定順序和密度固定在載體（如載玻片或硅片、尼龍膜、硝酸纖維素膜、塑料片等） 上形成陣列，與實際樣本（或核酸擴增產(chǎn)物）進行雜交反應，通過雜交信號分析可高通量獲 得所有待檢基因的信息。該技術(shù)以其高通量、快速、準確性高等優(yōu)點為感染病原學診斷提供 了一條新的解決途徑，對患者感染性疾病的臨床治療、預后評估具有重要作用。
[0007] 細菌核糖體RNA(rRNA)是細菌生命的標志，其16SrRNA基因以多拷貝形式存在于 所有細菌染色體基因中。國外20世紀90年代即有利用細菌16SrRNA基因結(jié)構(gòu)特點構(gòu)建 基因芯片，并將其應用于細菌鑒定的報道。近年來，國內(nèi)有人致力于以硝酸纖維膜和尼龍 膜等不同載體和地高辛、膠體金顯色等方法制備的寡核苷酸芯片技術(shù)用于臨床檢測腦脊液 細菌的研究，但存在臨床常見腦脊液致病菌覆蓋不全、雜交時間長等不足，特別是缺少大樣 本臨床驗證數(shù)據(jù)而限制了其臨床應用價值。目前市場上最主要的基因芯片產(chǎn)品是以點樣等 方法制備的用于基因表達檢測的中、低密度基因芯片?；蛐酒囊粋€重要發(fā)展趨勢是芯 片制備、樣品處理、雜交、檢測以及數(shù)據(jù)分析的標準化，提高基因芯片的準確性和可靠性。因 此，如何即保證檢測高通量，又保證芯片性能優(yōu)越性是其的瓶頸問題之一。而利用基于細菌 16SrRNA基因的多位點芯片檢測多種中樞神經(jīng)感染細菌病原體，發(fā)揮其操作簡單、通量大、 結(jié)果準確等特點，對于臨床分析中樞神經(jīng)感染細菌病原體及種類具有重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)細菌性感染者腦脊 液中病原菌的基因芯片及試劑盒，其解決了利用基于細菌16SrRNA基因的多位點芯片檢測 多種中樞神經(jīng)感染細菌病原體的問題。
[0009] 本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)細菌性感染者腦脊液中病原菌 的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡核苷酸探針，其特征在于：所述寡核 苷酸探針包括在基質(zhì)上設置的細菌16SrRNA通用探針、革蘭陽性細菌通用探針、革蘭陰性 細菌通用探針以及鑒定細菌的種、屬特異性探針，所述鑒定細菌的種、屬特異性探針為如 SEQIDNO:1-N0 :14所示的堿基序列的DNA片段，所述細菌16SrRNA通用探針為如SEQID N0:15所示的堿基序列的DNA片段，所述革蘭陽性細菌通用探針為如SEQIDN0:16所示的 堿基序列的DNA片段，所述革蘭陰性細菌通用探針為如SEQIDNO:17所示的堿基序列的 DNA片段。
[0010] 進一步地，上述鑒定細菌的種、屬特異性探針5'端含有氨基修飾的聚dT串，所述 氨基修飾的聚dT串為16聚的聚脫氧胸苷酸。
[0011] 進一步地，該基因芯片還包括如SEQIDN0:18所示的標記有生物素點的DNA序 列。
[0012] 進一步地，所述固相載體為修飾玻片或娃片。
[0013] 本發(fā)明的另一目的還在于提供一種用于檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)細菌性感染者腦脊液 中病原菌的試劑盒，其特征在于：包括如權(quán)利要求1所述基因芯片。
[0014] 進一步地，所述試劑盒還包括SEQIDNO:19-N0 :20所示的引物序列。
[0015] 進一步地，所述引物的5'端帶有標記基團，所述標記基團包括：地高辛分子、生物 素分子、熒光素及其衍生物分子、Cy3、Cy5、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶。
[0016] 本發(fā)明的再一目的是提供一種檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)細菌性感染者腦脊液中病原菌 感染的方法。其特征在于：包括如下步驟：
[0017] (1)用常規(guī)方法制備模板DNA(從患者腦脊液中提取包含可能感染細菌的DNA樣 本）；
[0018] ⑵用權(quán)利要求6所述引物序列將步驟⑴中制備的模板DNA通過PCR反應進行 擴增，獲得5'端帶有標記基團DNA擴增產(chǎn)物；
[0019] (3)將步驟（2)中DNA擴增產(chǎn)物與雜交緩沖液混合；
[0020] (4)將步驟（3)中所得混合液與權(quán)利要求3所述的基因芯片上面分布的DNA探針、 Bio進行雜交反應；
[0021] (5)完成步驟（4)雜交反應后，檢測基因芯片的雜交信號，根據(jù)標記信號在基因芯 片上的位置、強度等信息獲取待測信息。
[0022] 進一步地，在所述步驟（4)前先將基因芯片與預雜交緩沖液進行預雜交。
[0023] 進一步地，所述步驟（2)中PCR反應的步驟，還包括：
[0024] 1)94°C預變性 5 分鐘；2)94°C變性 45s;3)58°C退火 45s;4)72°C延伸 60s，重復 2)-4) 30次；5)最后72°C延伸7min的反應步驟。
[0025] 本發(fā)明適用于從腦脊液等臨床標本中直接提取病原菌DNA用于PCR擴增，靶基因 用于雜交檢測，可用于疑似細菌性感染的病原體篩查。本發(fā)明以固體材料載體為基質(zhì)，便于 生產(chǎn)和操作；用細菌通用引物PCR方法擴增細菌靶基因，避免了費時的培養(yǎng)階段，大大縮短 了檢測時間（約4小時左右）；利用標記的靶序列和基質(zhì)上的寡核苷酸探針進行雜交的鑒 定方法較