用于檢測蛋白質(zhì)和核酸的納米孔生物傳感器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基于修飾的溶細(xì)胞素蛋白質(zhì)的納米孔生物傳感器。所述納米孔生物傳 感器容納大分子，所述大分子包括折疊的蛋白質(zhì)和核酸，所述核酸包括雙鏈（ds)DNA，所述 納米孔生物傳感器與其他納米孔生物傳感器相比，顯示出增強的活性，溶解性和電性質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002] 離子或分子穿過生物膜的運輸是細(xì)胞生命的基本過程，且所述運輸被離子通 道，轉(zhuǎn)運蛋白（transporter)和孔緊密地調(diào)節(jié)。最近，研究者在單分子分析中采用生物 的，1固態(tài)的， 2DNA折紙3和混合的3a'b'4納米孔。5生物納米孔與它們的合成對應(yīng)物相比 具有優(yōu)勢，主要是因為它們可以重復(fù)制造并以人工納米孔無法匹敵的原子水平精度修 飾。然而，生物納米孔仍有缺點。生物納米孔的機械穩(wěn)定性取決于具體情況。來自金黃 色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)的α溶血素（aHL)納米孔和來自恥垢分枝桿菌 (Mycobacteriumsmegmatis)的孔蛋白A(MspA)納米孔在脂類雙分子層中在高施加電勢下 保持打開，而且令人驚訝的是能很好地對抗溫度，6pH6M和變性劑濃度的極端條件。&'8然 而，多數(shù)其他孔蛋白和通道不太牢固。然而，可認(rèn)為地，生物納米孔最大的不利條件是其固 定的尺寸。例如，aHL，MspA或氣單胞菌溶素納米孔的尺寸允許對單鏈核酸、適配子或小肽 進行分析，9但是它們較小的內(nèi)直徑（~lnm)妨礙了對其他重要生物系統(tǒng)例如折疊的酶或 核酶的直接研究。
[0003] 最近大量的研究對折疊蛋白質(zhì)迀移穿過人工納米孔進行了采樣。w然而，對具有固 態(tài)納米孔的蛋白質(zhì)的研究是困難的，因為蛋白質(zhì)具有不均勻的電荷分布，它們經(jīng)常吸附到 納米孔表面而且它們太快迀移而不能合適地取樣。&進一步地，由于蛋白質(zhì)具有緊密折疊 結(jié)構(gòu)，納米孔的直徑應(yīng)該與蛋白質(zhì)的直徑相似。最近，我們已經(jīng)介紹了作為第一生物納米 孔的來自傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphi)的溶細(xì)胞素A(ClyA)，其能夠?qū)μ烊徽郫B蛋白 質(zhì)進行研究。7aClyA結(jié)構(gòu)對于這項任務(wù)是理想的，因為蛋白質(zhì)例如凝血酶（37kDa)或蘋果 酸脫氫酶（二聚體，35kDa單體）可在寬的順式入口（5.5nm，表1)和窄的反式出口（3.3nm， 表1)之間被電泳捕獲，并可因此采樣若干分鐘。因為離子電流穿過ClyA對于前庭環(huán)境非 常敏感，因此人和牛的凝血酶的阻斷可以非常容易被識別。7a我們的工作是基于ClyA結(jié)構(gòu)， 所述ClyA結(jié)構(gòu)中，ClyA-WT(C87和C285)的兩個天然半胱氨酸殘基被絲氨酸（ClyA-SS)取 代。7a然而，當(dāng)與ClyA-WT單體相比時，ClyA-SS單體顯示低的水溶解性和低活性（圖S1)， 且在施加的電勢高于+60mV或低于-90mV時，ClyA-SS單體在平面脂類雙分子層中自發(fā)地 打開和關(guān)閉（門控（gated))。
[0004] 因此，現(xiàn)有技術(shù)中仍需要具有對目標(biāo)分析物的高靈敏度和在電勢范圍內(nèi)具有高水 溶性和穩(wěn)定性的納米孔生物傳感器。所述納米孔生物傳感器應(yīng)具有良好的寡聚性、電壓依 賴型門控性和在單通道電流記錄中的電噪音性能。本發(fā)明涉及工程納米孔，與ClyA-WT和 ClyA-SS相比，在所述納米孔中對天然半胱氨酸殘基和其他殘基的特定取代賦予了其額外 的性質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個方面涉及包含多個亞基的修飾的ClyA孔，其中每個亞基包含由與 SEQIDN0:1至少80%相同的氨基酸序列表示的多肽，其中精確地只有一個Cys殘基被Ser取代。在一些實施方式中，Cys殘基是C285。在某些實施方式中，修飾的ClyA孔的每個亞 基包括至少一個額外的選自L99Q，E103G，F(xiàn)166Y和K294R的氨基酸取代基。例如，每個亞基 可以包含由SEQIDN0:2的氨基酸序列表示的多肽。在某些實施方式中，在每個亞基中精 確地只有一個Cys殘基被Ala取代。在一些實施方式中，修飾的ClyA孔的每個亞基包括 至少一個額外的選自L203V和H207Y的氨基酸取代基。例如，每個亞基可以包含由SEQID NO:3的氨基酸序列表示的多肽。
[0006] 在一些實施方式中，修飾的ClyA孔包含至少12個亞基。例如，修飾的ClyA孔可 以包含12個亞基或者可以包含13個亞基。在某些實施方式中，修飾的ClyA孔具有至少 3. 5nm的順式直徑。在某些實施方式中，修飾的ClyA孔具有至少6nm的反式直徑。在一些 實施方式中，當(dāng)穿過修飾的ClyA孔的電壓范圍從-60+90到-150mV時，修飾的ClyA孔保持 打開。
[0007] 在一些實施方式中，蛋白質(zhì)分析物結(jié)合到修飾的ClyA孔的內(nèi)腔中。蛋白質(zhì)分析物 可以結(jié)合到修飾的ClyA孔的內(nèi)腔中的多于一個的位點。在一些實施方式中，蛋白質(zhì)分析物 是一種具有15_70kDa分子量范圍的蛋白質(zhì)。
【附圖說明】
[0008] 圖1顯示了由來自大腸桿菌ClyA結(jié)構(gòu)的同源建模構(gòu)造的傷寒沙門氏菌ClyA納米 孔（PDB:2WCD，90%序列同一性）的條帶代表圖。17在圖la中，1個原體突出顯示，其次級 結(jié)構(gòu)元素從N至C端用深灰色遮蔽，其它原體以淺灰色交替顯示。通過定向進化實驗改變 的氨基酸的側(cè)鏈以球形展示。兩個天然半胱氨酸殘基和苯丙氨酸166被標(biāo)記。圖lb表明 了ClyA-SS、ClyA-CS和ClyA-AS相對于ClyA-WT的序列變化。
[0009] 圖2顯示了ClyA-WT，ClyA-SS和進化的ClyA變體的寡聚化和納米孔的形成。圖 2a顯示了ClyA納米孔的寡聚，所述寡聚通過4-20%的BN-PAGE檢測。蛋白質(zhì)（lmg/ml)在 負(fù)載到凝膠中之前用0.5%DDM在室溫預(yù)孵化30分鐘（40μg/泳道）。泳道1:蛋白質(zhì)梯 度，泳道 2:ClyA-WT，泳道 3:ClyA-SS，泳道 4:ClyA-AS，泳道 5:ClyA-CS。圖lb顯示了單一 的納米孔電導(dǎo)分布，其是由ClyA-WT納米孔（頂部），ClyA-CS納米孔（中間）和ClyA-AS 納米孔（底部）在〇. 5%DDM中預(yù)寡聚之后的平面脂質(zhì)雙分子層中重新構(gòu)成的100個納米 孔獲得。在_35mV，15mMTris.(三羥甲基氨基甲烷）HCl，pH7. 5, 150mMNaCl中進行記錄， 溫度為28°C。
[0010] 圖3顯示了 62個ClyA-CS納米孔的單一電導(dǎo)，所述納米孔是從在4-20 %丙烯酰胺 BN-PAGE上分離的ClyA-CS的最低（圖3a)，第二最低（圖3b)和第三最低（圖3c)的寡聚 帶中提取出的。ClyA-CS單體在0. 5%DDM中預(yù)孵化并負(fù)載到圖2所描述的BN-PAGE上。切 除的帶被方框框住并在插圖上用箭頭標(biāo)注。在_35mV，28°C的pH= 7. 5的包含150mMNaCl 的15mMTris.HCl中進行記錄。
[0011] 圖4顯示了在三種類型的ClyA-CS納米孔上由HT引發(fā)的電流阻塞。在圖4a中，從 左到右，穿過I型，II型和III型ClyA納米孔（灰色），各所述納米孔的前庭中包含HT(黑）。II型和III型ClyA納米孔如在補充信息中所述的被建模為13聚體（13mer) (II型）或14 聚體（III型）。圖4b顯示了 -35mV時對I型（左），II型（中）或III型（右）ClyA-CS 納米孔的HT阻塞。對I型和II型ClyA-CS的HT電流阻塞在LI(IRES%分別=56± 1和 68±1)和L2(IRES%分別=23±3和31±1)電流水平之間切換。阻塞持續(xù)若干分鐘，所以 只顯示第一秒的電流軌跡。在I型ClyA-CS中，L1最具代表性的電流阻塞（70% )，而在II 型ClyA-CS中，L2占大多數(shù)（96% )。對于III型ClyA-CS納米孔的HT電流阻塞只顯示L2 電流水平（IRES= 32±9)。在-35mV，15mMTris.HC1,pH= 7. 5, 150mMNaCl中進行記錄。 應(yīng)用2000Hz截止值的貝塞爾低通濾波器（Bessellow-passfilter)進行圖4b的收集并 在10kHz采樣，溫度為28°C。
[0012] 圖5顯示了蛋白質(zhì)穿過I型和II型ClyA-CS納米孔的迀移。圖5a顯示了針對I 型（空心圓圈）和II型（填充矩形）ClyA-CS納米孔所確定的HT阻塞停留時間的電壓依 賴性。由至少50個阻塞的停留時間建立累積分布（ηS3)的單指數(shù)擬合計算在各電壓下 的壽命。線表示對實驗點的雙指數(shù)擬合。圖5b顯示了在-150mV對于I型（左）和II型 (右）ClyA-CS納米孔的HT電流阻塞。所述阻塞只顯示兩種納米孔的L2電流水平（對I型 和II型ClyA-CS，分別為IRES%= 23±2 和 31±5)。圖 5c顯示了在-150mV，I型ClyA-CS 的典型HT電流阻塞，其顯示出"肩值"和"尖值"的電流特征。在20nMHT存在下在15mM Tris.HCl、pH= 7. 5、150mMNaCl中進行記錄。應(yīng)用2000Hz截止值的貝塞爾低通濾波器進 行圖5b中軌跡的收集，并在10kHz采樣。應(yīng)用10Hz截止值的貝塞爾低通濾波器收集C中 的軌跡，并在50kHz采樣。溫度是28°C。誤差以標(biāo)準(zhǔn)偏差給出。
[0013] 圖6顯示了純化的ClyA單體的表征。a)通過4-20%的丙烯酰胺BN-PAGE檢測純 化的ClyA單體的溶解度。各等量份（40μg)的純化的ClyA單體（無洗滌劑）用約10% 甘油和1倍的天然PAGETM電泳緩沖液（lxofNativePAGETMRunningBuffer)和1倍 的陰極緩沖液添加劑（InvitrogenTM)進行補充并被加載到各泳道：泳道1:標(biāo)記物，泳道 2:ClyA-WT，泳道 3:ClyA-SS，泳道 4:ClyA-CS，泳道 5:ClyA-AS。b)ClyA變體的過量表達(dá)。 各等量份的細(xì)菌顆粒進行重懸浮，至約l〇〇mg/mL的濃度并通過超聲處理進行分裂，然后在 20000g離心10分鐘（4°C)，所述細(xì)菌顆粒來源于超量表達(dá)ClyA變體的過夜培養(yǎng)物。20μL 含有ClyA蛋白質(zhì)的可溶片段（fraction)的上清液被加載到12%的丙稀酰胺SDS-PAGE的 泳道 2,4,6,8 上。通過添加包含 15mMTris.HCl、pH= 7. 5、150mMNaCl和 2%SDSw/v的 溶液將裂解的顆?；氐皆俭w積。20μL這樣的溶液被加載到同樣12%丙烯酰胺SDS-PAGE 的泳道3、5、7和9上。因此，泳道1:蛋白質(zhì)標(biāo)記物，泳道2和3:分別為ClyA-SS的上清液和 顆粒片段；泳道4和5:分別為ClyA-WT的上清液和顆粒片段；泳道6和7:分別為ClyA-CS 上清液和顆粒片段，泳道8和9:分別為ClyA-AS的上清液和顆粒片段。c)溶血性分析。 ClyA單體（0. 6μM)用100μL的1 %馬的紅細(xì)胞懸浮液孵化（最終體積110μL)，濁度的減 少在650nm(0D650nm)測量。ClyA-WT顯示為粗灰線，ClyA-SS以粗黑線顯示，ClyA-CS以細(xì) 黑線顯示，ClyA-AS以虛線顯示。d)溶血率（以時間的倒數(shù)達(dá)到50%的濁度而計算）按蛋 白質(zhì)濃度繪圖，ClyA-WT(三角形，粗灰色線），ClyA-SS(正方形、粗黑線），ClyA-AS(圓形， 虛線）和ClyA-CS(菱形，細(xì)黑線）。
[0014] 圖7顯示了利用4-20%丙烯酰胺BN-PAGE篩分ClyA變體的寡聚反應(yīng)的實施例。 a)第4輪（Round4)，1泳道和2泳道：ClyA-CS，3泳道和4泳道：4ClyA5, 5泳道和6泳 道：4ClyA3, 7泳道和8泳道：4ClyAl，9泳道和10泳道：4ClyA2,11泳道和12泳道：4ClyA6。 按圖6中的說明并補充0· 05% (偶數(shù)泳道數(shù)）或0· 1% (奇數(shù)泳道數(shù)）SDS而制備樣品。SDS 用來對抗樣品中大量DDM的"拖尾"效應(yīng)。b)第5輪。泳道l、2:5ClyA2,泳道3:5ClyAl，泳 道4:ClyA-AS。樣品補充0. 05%SDS。通過添加1%DDM引發(fā)寡聚反應(yīng)，ClyA變體利用方 法中所描述的Ni-NTA親和色譜法進行部分純化。
[0015] 圖8顯示了在-35mV電勢下，在150mMNaCl, 15mMTris.HC1中，三種類型ClyA納 米孔的噪音特征。從〇· 5s軌跡獲得I型（短劃線），II型（點線）和III型（淺灰色實 線）ClyA-CS納米孔在-35mV的電流功率譜密度。在OmV的電流功率譜密度如黑線所示。每 條線對應(yīng)由針對不同的單通道進行的3組記錄計算得到的功率譜的平均值。
[0016] 圖9顯示了HT(a)和FP(b)阻塞在I型ClyA-SS孔上的持續(xù)時間。利用設(shè)置在 2kHz的內(nèi)部貝塞爾低通濾波器以10kHz采樣率記錄軌跡。每個繪制的值對應(yīng)于利用至少3 個不同的單通道確定的平均值。誤差以標(biāo)準(zhǔn)偏差給出。
[0017] 圖10顯示了 _150mV在I型ClyA上的典型的HT電流阻塞，其顯示出"肩值"和"尖 值"的電流特征。在15mMTris.HCl、pH= 7. 5、150mMNaCl中在20nMHT存在下進行記錄。 利用具有10, 000Hz截止濾光片的高斯低通濾波器過濾軌跡，并在50, 000Hz進行采樣。
[0018] 圖11顯示了dsDNA(雙鏈DNA)迀移穿過ClyA納米孔。在電流軌跡的右邊，描繪 了ClyA(孔形結(jié)構(gòu)）和中性親和素（neutravidin)(深灰色），且dsDNA顯示為黑線。a)來 自傷寒沙門氏菌的ClyA的區(qū)段穿過性（sectionsthrough)，來自傷寒沙門氏菌的ClyA通 過來自大腸桿菌ClyA結(jié)構(gòu)的同源建模而構(gòu)成（PDB:2WCD，90%序列同一性）。22ClyA以孔 的測量值顯示，測量值包括原子的范德瓦爾斯半徑，和殘基103 (WT序列中的絲氨酸）在所 示孔上的大致位置。b)在 +100mV(水平 1。+1。。= 1. 74±0· 05nA)，0· 12μΜ的 290bpdsDNA 1添加到ClyA納米孔的順式側(cè)引起了短暫的電流阻塞IRES= 0. 63±0. 01 (水平1* +1。。= 1. 10±0.03ηΑ，η= 3)，這是由于dsDNA迀移穿過所述孔而致。中性親和素到順式腔室的 添加將所述短暫的電流阻塞轉(zhuǎn)變?yōu)楦邔?dǎo)電性和持久的電流阻塞IRES= 〇. 68±0. 01 (水平 1+1。。= 1. 19±0.01)，這是由于DNA穿過所述孔而發(fā)生局部迀移。開孔電流通過將電勢反轉(zhuǎn) 到-100mV(紅色星號）而恢復(fù)。附圖顯示了典型的瞬時電流阻塞。c)由于在+100mV順式 準(zhǔn)輪燒（pseudorotaxane)的形成而產(chǎn)生的電流阻塞的詳情展示。d)在-100mV通過dsDNA: 中性親和素的復(fù)合物（見上文）從反式側(cè)螺旋化而實現(xiàn)的反式準(zhǔn)輪烷的形成（水平11DD = 1. 02±0· 03nA,IRES= 0· 62±0· 01，n= 4)。在 22Γ，在pH= 7. 5 的 2· 5MNaCl, 15mMTris. HC1中實施電記錄。通過采用10kHz貝塞爾低通濾波器并利用20μs(50kHz)的采樣率記錄 數(shù)據(jù)。
[0019] 圖12顯示了納米孔-DNA輪燒的形成。a)表示用于形成輪燒的DNA分子的雜 化。箭頭指示鏈的3'端。b)輪烷形成。在-100mV將復(fù)合有中性親和素（0.3μΜ)和寡 核苷酸（〇lig〇)4(lyM)的DNA雜種3(1μΜ)添加到反式腔室之后，ClyA-2的開孔電流 (101。。= -1·71±0·07ηΑ，η = 4)減少到水平1 1M= 1. l±0.04nA(IRES值為0·64±0·02，η =4)，這表明dsDNA從反式側(cè)使所述孔螺旋化。步進達(dá)到+100mV(紅色星號）生產(chǎn)IRES = 0. 77±0. 04(水平2+1。。= 1.31±0. 09nA，n = 4)的電流阻塞，這表明DNA在正的施加電勢 下仍占據(jù)該孔。水平2最有可能對應(yīng)于占據(jù)所述孔的前庭的ssDNA。連續(xù)切換到正的施 加電勢不能恢復(fù)開孔電流（圖16)，這證實了輪烷的形成是永久性的。c-e)去除輪烷。c) 在+100mV，穿過ClyA-2納米孔的離子電流顯示出大量的快的電流阻塞（圖15)，這表明在 所述孔的順式入口處連接的ssDNA分子瞬時地占據(jù)了所述孔的內(nèi)腔。d)輪烷形成后（圖 12b)，在+100mV納米孔顯示穩(wěn)定的離子電流（水平2+1。。)，這表明單個DNA分子正占據(jù)該 孔。e) 20mMDTT添加到順式腔室后20分鐘，在ClyA孔上面的DNA分子被移除，開孔電流在 +100mV時恢復(fù)（1。+1。。= 1. 78±0. 07,η= 4)。如圖11所描述的進行記錄。
[0020] 圖 13 顯示了對ClyA-CS的ssDNA阻塞。在 +100mV，2μΜ生物素化的ssDNA(5a) 在0. 6μΜ中性親和素存在下添加到ClyA-CS納米孔的順式一側(cè)，引起瞬時電流阻 塞（1.24±0.02nA，IRES= 0·69±0·04，η= 3)，這表明ssDNA可以進入所述孔的內(nèi)腔， 但只是暫時性的。隨后添加互補的ssDNA鏈（5b)將電流阻塞轉(zhuǎn)變成水平1+1。。阻塞 (1. 22±(X13nA，IRES=(λ67±0· 01，η= 3)，這表明dsDNA現(xiàn)在可以迀移穿過所述孔的整個 長度。
[0021] 圖14顯示了DNA穿過ClyA納米孔的轉(zhuǎn)運。a)表示鏈置換反應(yīng)的示意圖，所述鏈 置換反應(yīng)促進DNA從所述孔的釋放。b)在+50mV且在3(0. 3μM)存在下，ClyA-2顯示了 穩(wěn)定的開孔電流（1。+5。= 〇. 85±0.OlnA,η= 3)，這表明連接到所述孔的ssDNA鏈沒有螺旋 穿過所述孔的內(nèi)腔并阻止dsDNA型溶液的迀移。c)ssDNA鏈6(40nM)添加到順式腔室產(chǎn)生 了持久的IRES= 〇. 70±0. 02(水平 2+5。= 0. 59±0. 02nA，n= 5)的電流阻塞，這表明dsDNA 雜種使所述孔螺旋化。d)隨后將也包含0. 3μΜ中性親和素的1μΜ的7添加到反式腔室 (+50mV)促進了DNA螺旋的釋放并恢復(fù)了開孔電流。隨后，如多個阻塞電流和開孔電流所 示，dsDNA分子順序地被捕獲并釋放。為了清楚起見，附圖中未包括中性親和素。在22°C、 pH= 7. 5的2. 5MNaCl和15mMTris.HC1中進行電記錄。通過采用10kHz貝塞爾低通濾波 器并利用20μs(50kHz)的采樣率記錄數(shù)據(jù)。對圖d中的電流信號在2kHz使用后捕獲低通 高斯濾波器進行數(shù)字濾波。由于在更高的施加電勢下，處于順式的DNA的捕獲非?？?，因此 該實驗的施加電勢設(shè)置在+50mV以促進對多個阻塞和釋放的觀察（圖14d)。
[0022] 圖15顯示了對比實驗的結(jié)果，其顯示出圖12的所有組分都是形成DNA輪烷所必 需的。a)橋接序列4的缺失會使得ClyA-2和3之間無法進行連接。在-100mV復(fù)合物被 捕獲之后，在+100mV(星號）所述復(fù)合物容易地被從孔中驅(qū)逐出，正如在+100mV時ClyA-2 的開孔電流的典型電流特征所示。b)當(dāng)在-100mV被捕獲時，2從孔頂部的缺失（例如 用DTT分裂后）無法使所述3 · 4DNA雜化以結(jié)合到所述孔。在電勢反轉(zhuǎn)到+100mV(紅色 星號）時，開孔電流恢復(fù)。c)在+100mV對于ClyA-2納米孔的典型的電流記錄。d)20秒 的a中所示電流軌跡的全點直方圖（5pA面元（bin)尺寸）。水平1。+1。。= 1. 71±0. 07nA, 水平A= 1. 62±0. 12nA,水平B= 1. 43±0. 05nA和水平C= 1. 28±0. 06nA，分別對應(yīng) 0. 94±0. 04, 0. 84±0. 03和0. 75±0. 03的IRES值。從12個實驗計算出的各值可以代表寄 宿在ClyA的內(nèi)腔中的DNA鏈。
[0023] 圖16顯示了ClyA-2納米孔的電流和電壓（IV)關(guān)系，a)輪烷形成之前（最淺的灰 線）和之后（黑線）的ClyA-2的典型曲線。中度灰色線表示在DNA分子連接到納米孔之后 的該同一納米孔通過添加DDT被移除。通過施加在4秒內(nèi)將電壓從-100mV轉(zhuǎn)變到+100mV 的自動化協(xié)議來測量電流記錄。b)從4個實驗的平均值計算電流-電壓曲線，該曲線顯示 出穩(wěn)態(tài)（Is)的ClyA-2開孔電流水平（白球）和輪烷構(gòu)型中的ClyA-2開孔電流水平（黑 球）。對于在正偏壓和負(fù)偏壓下的ClyA-2,從電流-電壓曲線的斜率計算的納米孔的單一 電導(dǎo)值是17.InS，對于負(fù)