用于核酸特異性雜化合物的模板化裝配的方法和組合物的制作方法
【專利說(shuō)明】用于核酸特異性雜化合物的模板化裝配的方法和組合物
[0001] 領(lǐng)域
[0002] 本公開(kāi)涉及模板化裝配的方法和包括核酸特異性雜化合物的模板化裝配反應(yīng)物 的組合物。
[0003] 背景
[0004] 藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)目標(biāo)是將強(qiáng)效的生物治療干預(yù)遞送至病原細(xì)胞，例如病毒感染細(xì) 胞、瘤性細(xì)胞、產(chǎn)生自體免疫反應(yīng)的細(xì)胞和其它調(diào)節(jié)異常或功能不良的細(xì)胞。能夠?qū)共≡?細(xì)胞的強(qiáng)效生物治療干預(yù)的實(shí)例包括毒素、促凋亡劑和重定向免疫細(xì)胞來(lái)消除病原細(xì)胞的 免疫治療方法。遺憾的是，開(kāi)發(fā)這些藥劑極為困難，因?yàn)榇嬖趯?duì)鄰近的正常細(xì)胞或患者的總 體健康具有毒性的尚風(fēng)險(xiǎn)。
[0005] 已經(jīng)出現(xiàn)的允許將強(qiáng)效干預(yù)遞送至病原細(xì)胞同時(shí)減輕對(duì)正常細(xì)胞的毒性的方法 是治療劑的靶向，這是通過(guò)將它們針對(duì)對(duì)病原細(xì)胞具有特異性的分子標(biāo)記物定向?qū)崿F(xiàn)的。 靶向治療劑已經(jīng)在有限的情況下顯示出非同尋常的臨床結(jié)果，但是由于缺少可用于靶向治 療的標(biāo)記物，目前其適用性有限。發(fā)現(xiàn)許多病原細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)標(biāo)記物是極為困難的且 經(jīng)常是不可能的。
[0006] 最近，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出靶向?qū)Σ≡?xì)胞具有特異性的核酸標(biāo)靶的療法?，F(xiàn)有的核酸靶 向療法例如siRNA能夠下調(diào)潛在危險(xiǎn)基因的表達(dá)，但是不遞送強(qiáng)效的細(xì)胞毒性干預(yù)或細(xì)胞 抑制干預(yù)，且因此在消除危險(xiǎn)細(xì)胞本身方面不是特別有效。
[0007] 因此，存在對(duì)抗現(xiàn)有生物治療干預(yù)的不良效率和/或嚴(yán)重副作用的需求。
[0008] 概要
[0009] 本公開(kāi)涉及用于制備和使用靶向模板化裝配反應(yīng)物的方法和產(chǎn)物。在一個(gè)方面， 靶向模板化裝配反應(yīng)物可以包括結(jié)合靶核酸序列的至少一個(gè)核酸識(shí)別部分、結(jié)合核酸識(shí)別 部分的至少一個(gè)選擇性反應(yīng)性部分和至少一個(gè)效應(yīng)物局部部分，其中該效應(yīng)物局部部分和 該選擇性反應(yīng)性部分能夠結(jié)合而產(chǎn)生活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)方面，靶向模板化裝配 反應(yīng)物可以包括至少一個(gè)核酸識(shí)別部分、至少一個(gè)生物正交部分和至少一個(gè)效應(yīng)物局部部 分。還公開(kāi)了一種合成靶向模板化裝配反應(yīng)物的方法，所述合成是通過(guò)產(chǎn)生能夠結(jié)合靶核 酸序列的至少一個(gè)核酸識(shí)別部分、產(chǎn)生能夠結(jié)合相應(yīng)的選擇性反應(yīng)性部分的至少一個(gè)選擇 性反應(yīng)性部分以及產(chǎn)生能夠結(jié)合相應(yīng)的效應(yīng)物局部部分以生成活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)的至少一 個(gè)效應(yīng)物局部部分。合成活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)的方法還包括產(chǎn)生至少兩種模板化裝配反應(yīng)物、 使靶向模板化裝配反應(yīng)物與靶核酸序列接觸以及生成活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)。本文還包括將至少 兩種靶向模板化裝配反應(yīng)物遞送至病原細(xì)胞的方法。所述方法可以包括向病原細(xì)胞施用治 療有效量的革G向模板化裝配反應(yīng)物并在病原細(xì)胞中生成至少一個(gè)活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，公開(kāi)了靶向模板化裝配組合物。核酸識(shí)別部分可以是核酸結(jié) 合寡聚物和可以與靶核酸序列雜交的核酸寡聚物。此類寡聚物的實(shí)例可以包括選自由以下 所組成的組的寡聚物：DNA核苷酸、RNA核苷酸、經(jīng)硫代磷酸酯修飾的核苷酸、2-0-烷基化 RNA核苷酸、鹵代核苷酸、鎖核酸核苷酸（LNA)、肽核酸（PNA)、嗎啉代核酸類似物、假尿苷核 苷酸、黃嘌呤核苷酸、次黃嘌呤核苷酸、2-脫氧肌苷核苷酸、能夠形成堿基對(duì)的其它核酸類 似物和其組合。核酸結(jié)合部分可以結(jié)合選自由以下所組成的組的靶核酸序列：致癌基因、突 變基因、致癌病毒基因、病毒核酸序列、微生物核酸序列、差異表達(dá)基因及其片段、部分或核 酸基因產(chǎn)物。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，選擇性反應(yīng)性部分結(jié)合至核酸識(shí)別部分。選擇性反應(yīng)性部分 可以連接至核酸識(shí)別部分。選擇性反應(yīng)性部分還可以是生物惰性的，例如生物正交反應(yīng)性 分子。選擇性反應(yīng)性部分的實(shí)例可以包括疊氮化物、環(huán)辛炔、硝酮、降冰片烯、氧雜降冰片二 烯、膦、二烷基膦、三烷基膦、膦基硫醇、膦基苯酚、環(huán)辛烯、氧化腈、硫酯、四嗪、異腈、四唑、 四環(huán)烷和其衍生物。
[0012] 效應(yīng)物局部部分還可以包括與選擇性反應(yīng)性部分結(jié)合的第一效應(yīng)物局部部分以 及與第一效應(yīng)物局部部分結(jié)合以生成活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)的第二效應(yīng)物局部部分。效應(yīng)物局部 部分還可以包括能夠與選擇性反應(yīng)性部分相互作用以生成活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)的化學(xué)連接子。 效應(yīng)物局部部分可以是肽、擬肽結(jié)構(gòu)的非活性部分、藥物的非活性部分或小于20kDa的其 它生物活性化合物。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，公開(kāi)了一種活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)。該活性效應(yīng)物可以包括至少一 個(gè)選擇性反應(yīng)性部分結(jié)構(gòu)與結(jié)合至該選擇性反應(yīng)性部分的至少一個(gè)效應(yīng)物局部部分的反 應(yīng)產(chǎn)物。該活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)還可以包括結(jié)合至該反應(yīng)產(chǎn)物的至少一個(gè)核酸識(shí)別部分?；钚?效應(yīng)物可以調(diào)節(jié)酶活性、基因/蛋白質(zhì)表達(dá)（例如調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)）、分子信號(hào)傳導(dǎo)和分 子相互作用中的至少一個(gè)和/或相較于效應(yīng)物局部部分的活性具有靶向活性?；钚孕?yīng)物 還可以誘導(dǎo)以下各項(xiàng)中的至少一個(gè)：免疫反應(yīng)、程序性細(xì)胞死亡、凋亡、程序性非特異性或 程序性壞死、裂解、生長(zhǎng)抑制、病毒感染的抑制、病毒復(fù)制的抑制、致癌基因表達(dá)的抑制、基 因表達(dá)修飾、微生物感染的抑制和微生物復(fù)制的抑制。在一個(gè)實(shí)施方案中，活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu) 為抗體。
[0014] 所述化學(xué)連接子還可以位于核酸識(shí)別部分與選擇性反應(yīng)性部分之間和/或選擇 性反應(yīng)性部分與效應(yīng)物局部部分之間和/或?yàn)槿嵝圆糠?、裂解位點(diǎn)和/或化學(xué)修飾位點(diǎn)。化 學(xué)連接子可以通過(guò)改善靶向模板化裝配組合物的溶解度、疏水性、電荷、細(xì)胞滲透性、毒性、 生物分布和穩(wěn)定性中的至少一個(gè)使核酸識(shí)別部分、生物正交部分和/或效應(yīng)物局部部分官 能化。化學(xué)連接子的實(shí)例可以包括烷基、烯基、酰胺、酯、硫酯、酮、醚、硫醚、二硫化物、乙二 醇、環(huán)烷基、芐基、雜環(huán)基、馬來(lái)酰亞胺基、腙、尿烷、唑類、亞胺、鹵代烷基、氨基甲酸酯和其 組合。靶核酸序列可以包括癌癥特異性核酸序列、病毒核酸序列、微生物特異性核酸序列、 差異表達(dá)基因、疾病特異性核酸序列和其片段、部分或核酸基因產(chǎn)物。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，公開(kāi)了一種合成模板化裝配反應(yīng)物的方法和一種合成活性效 應(yīng)物結(jié)構(gòu)的方法。所述方法還可以包括測(cè)定核酸識(shí)別部分、選擇性反應(yīng)性部分和效應(yīng)物局 部部分生成活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)的能力。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，公開(kāi)了一種將至少兩種靶向模板化裝配反應(yīng)物遞送至病原細(xì) 胞的方法。該方法還可以包括在施用靶向模板化裝配組合物之前檢測(cè)是否存在靶核酸序 列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括誘導(dǎo)下列各項(xiàng)中的至少一個(gè)：病原細(xì)胞的程序性細(xì)胞 死亡、病原細(xì)胞的凋亡、病原細(xì)胞的非特異性或程序性壞死、病原細(xì)胞的裂解和病原細(xì)胞的 生長(zhǎng)抑制。
[0017] 所施用的組合物還可以包括兩組或更多組模板化裝配反應(yīng)物，其中一組模板裝配 反應(yīng)物包括靶向模板化裝配反應(yīng)物和相應(yīng)的靶向模板化裝配反應(yīng)物。所述組還可以包括能 夠結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)靶核酸序列的兩組或更多組核酸識(shí)別部分。兩個(gè)或更多個(gè)靶核酸序列 可以被發(fā)現(xiàn)在相同的基因轉(zhuǎn)錄物內(nèi)或在不同和分開(kāi)的轉(zhuǎn)錄物上。識(shí)別相同細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物中的 不同核酸靶序列的兩組或更多組相應(yīng)的模板化裝配反應(yīng)物可以獨(dú)立地?cái)y帶相同的效應(yīng)物 局部結(jié)構(gòu)，它們以模板導(dǎo)向方式反應(yīng)形成相同效應(yīng)物產(chǎn)物的額外拷貝。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，識(shí)別不同和分開(kāi)的核酸靶序列的兩組或更多組相應(yīng)的模板化 裝配反應(yīng)物可以攜帶相同的效應(yīng)物局部結(jié)構(gòu)，其以模板導(dǎo)向方式反應(yīng)形成效應(yīng)物產(chǎn)物。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，識(shí)別相同的細(xì)胞核酸靶序列的兩組或更多組相應(yīng)的模板化裝 配反應(yīng)物可以攜帶不同的效應(yīng)物局部結(jié)構(gòu)，其以模板導(dǎo)向方式反應(yīng)形成不同的效應(yīng)物產(chǎn) 物。兩組或更多組模板化裝配反應(yīng)物可以包括能夠產(chǎn)生兩個(gè)或更多個(gè)活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)的效 應(yīng)物局部部分。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，識(shí)別不同和分開(kāi)的核酸靶序列的兩組或更多組相應(yīng)的模板化 裝配反應(yīng)物可以攜帶不同的效應(yīng)物局部結(jié)構(gòu)，其以模板導(dǎo)向方式反應(yīng)形成不同的效應(yīng)物產(chǎn) 物。在所述組合物中包含兩組或更多組效應(yīng)物局部部分的實(shí)施方案中，可以產(chǎn)生兩個(gè)或更 多個(gè)活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)以誘導(dǎo)兩種或更多種效應(yīng)物活性。
[0021] 所述病原細(xì)胞可以是病毒感染細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和微生物感染細(xì)胞，或產(chǎn)生導(dǎo)致疾 病的分子的細(xì)胞，例如產(chǎn)生誘導(dǎo)過(guò)敏、過(guò)敏反應(yīng)或自體免疫疾病的抗體或介導(dǎo)疾病的細(xì)胞 因子的細(xì)胞。在病原細(xì)胞是病毒感染細(xì)胞的實(shí)施方案中，所述方法可以進(jìn)一步包括誘導(dǎo)下 列各項(xiàng)中的至少一個(gè)：病毒感染細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡、病毒感染細(xì)胞的凋亡、病毒感染 細(xì)胞的非特異性或程序性壞死、病毒感染細(xì)胞的裂解、病毒感染的抑制和病毒復(fù)制的抑制。 在病原細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞的實(shí)施方案中，所述方法可以進(jìn)一步包括誘導(dǎo)下列各項(xiàng)中的至少一 個(gè)：腫瘤細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡、腫瘤細(xì)胞的凋亡、腫瘤細(xì)胞的非特異性或程序性壞死、月中 瘤細(xì)胞的裂解、腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制、腫瘤細(xì)胞中的致癌基因表達(dá)的抑制和腫瘤細(xì)胞中的 基因表達(dá)的修飾。在病原細(xì)胞是微生物感染細(xì)胞的實(shí)施方案中，所述方法可以進(jìn)一步包括 誘導(dǎo)下列各項(xiàng)中的至少一個(gè)：微生物感染細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡、微生物感染細(xì)胞的凋亡、 微生物感染細(xì)胞的非特異性或程序性壞死、微生物感染細(xì)胞的裂解、微生物感染的抑制和 微生物復(fù)制的抑制。在病原細(xì)胞產(chǎn)生疾病介導(dǎo)分子的實(shí)施方案中，所述方法可以包括誘導(dǎo) 下列各項(xiàng)中的至少一個(gè)：疾病誘導(dǎo)細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡、疾病誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡、疾病誘導(dǎo) 細(xì)胞的壞死、疾病誘導(dǎo)細(xì)胞的裂解和疾病介導(dǎo)分子產(chǎn)生的抑制。
[0022] 附圖簡(jiǎn)述
[0023] 本文已經(jīng)包含附圖以使得本公開(kāi)的上述特征、優(yōu)點(diǎn)和目標(biāo)將變得清楚且可以被詳 細(xì)理解。這些圖示形成本說(shuō)明書(shū)的一部分。然而，應(yīng)該注意，【附圖說(shuō)明】本公開(kāi)的實(shí)施方案且 不應(yīng)該被視為限制本公開(kāi)的范圍。
[0024] 圖1A是包括兩種不同化合物的模板化裝配反應(yīng)物的一個(gè)實(shí)施方案的圖解說(shuō)明。 圖1A示出了在靶核酸模板上的兩個(gè)核酸識(shí)別部分之間的相互作用，指示不同的效應(yīng)物局 部部分（A和B)和不同的選擇性反應(yīng)性部分（1和2)。
[0025] 圖1B是包括兩種或更多種不同化合物的模板化裝配的另一個(gè)實(shí)施方案的圖解說(shuō) 明。圖1B示出了使用三個(gè)效應(yīng)物局部結(jié)構(gòu)（A、B、C)和兩個(gè)選擇性反應(yīng)性部分（1和2)的 三方裝配。核酸識(shí)別部分的5'端連接至具有選擇性反應(yīng)性部分2的雙重修飾的效應(yīng)物局 部部分B，以促進(jìn)形成三方反應(yīng)產(chǎn)物。
[0026]圖1C是其中模板化裝配反應(yīng)物由化學(xué)連接子連接的模板化裝配的另一個(gè)實(shí)施方 案的圖解說(shuō)明。圖1C描繪了通過(guò)單分子配置進(jìn)行的模板化裝配，其中單一核酸識(shí)別部分的 5'端和3'端被選擇性反應(yīng)性部分修飾，且后者僅在特異性核酸標(biāo)靶的存在下變成空間并 列。
[0027] 圖2A是含有特異性靶RNA分子（代表任何一般靶向核酸）的細(xì)胞靶隔室和具有 效應(yīng)物局部結(jié)構(gòu)和5'和3'生物正交反應(yīng)性部分的兩個(gè)參與性模板化裝配反應(yīng)物的圖解說(shuō) 明。將模板化裝配反應(yīng)物共遞送至靶隔室中用于接近靶RNA。
[0028] 圖2B示出了每個(gè)模板化裝配反應(yīng)物雜交至靶RNA上以使得生物正交反應(yīng)性部分 并列地用于反應(yīng)。Ν'表示針對(duì)每個(gè)模板化裝配反應(yīng)物中的每個(gè)堿基N的靶RNA鏈中的互補(bǔ) 喊基。
[0029] 圖2C示出了模板化裝配連接產(chǎn)物和裝配效應(yīng)物結(jié)構(gòu)的實(shí)例：1)非無(wú)痕跡連接；2) 無(wú)痕跡連接；和3)無(wú)痕跡連接和在從載體核酸化學(xué)或酶促裂解后的游離效應(yīng)物結(jié)構(gòu)。
[0030] 圖3是模板化裝配反應(yīng)物合成的步驟的流程圖；圖4示出了一種利用核酸模板化 裝配產(chǎn)生所需生物活性的方法的流程圖。方框代表需要從業(yè)人員的行動(dòng)的步驟；橢圓代表 在施用后自然發(fā)生的步驟。
[0031]圖5是描繪受試者內(nèi)的靶定位和靶向模板化裝配產(chǎn)物對(duì)定位靶的特異性的圖解 說(shuō)明。
[0032] 圖6是用于選擇性消除腫瘤細(xì)胞的治療用途的一個(gè)實(shí)例的圖解說(shuō)明-治療前。
[0033] 圖7是用于選擇性消除腫瘤細(xì)胞的治療用途的一個(gè)實(shí)例的圖解說(shuō)明-治療期間的 雜交。
[0034] 圖8是描繪在靶細(xì)胞中產(chǎn)生并通過(guò)以下不同的機(jī)制起作用來(lái)誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)物 結(jié)構(gòu)的圖解說(shuō)明：細(xì)胞毒性Τ淋巴細(xì)胞、治療性抗體、細(xì)胞內(nèi)受體、直接細(xì)胞相互作用。
[0035] 圖9是使用多個(gè)反應(yīng)物（反應(yīng)物Α和Β)的靶向模板化裝配產(chǎn)物的圖解說(shuō)明。多 個(gè)核酸識(shí)別部分與靶序列雜交且使得反應(yīng)物組合產(chǎn)生活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)。
[0036] 圖10是說(shuō)明模板化裝配反應(yīng)物在受試者樣本中的診斷評(píng)價(jià)的圖解。
[0037]圖11是示出了由在各種雜交溫度下的核酸模板化裝配產(chǎn)生的連接產(chǎn)物的凝膠， 其中在模板化后殘余極少的非連接產(chǎn)物。
[0038] 圖12示出了在抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞被經(jīng)過(guò)處理的腫瘤細(xì)胞刺激中的IL-2釋 放。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 現(xiàn)在將描述某些示例性實(shí)施方案以提供本文所公開(kāi)的組合物和方法的結(jié)構(gòu)、功 能、制造和使用的原理的全面理解。這些實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)實(shí)例說(shuō)明于附圖中。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本文所明確描述且在附圖中說(shuō)明的組合物和方法是非限制性示例性 實(shí)施方案且本公開(kāi)的范圍僅由權(quán)利要求書(shū)限定。結(jié)合一個(gè)示例性實(shí)施方案所說(shuō)明或描述的 特征可以與其它實(shí)施方案的特征組合。此類修改和變化意圖包含在本公開(kāi)的范圍內(nèi)。
[0040] 傳統(tǒng)靶向治療受到靶抗原的可用性、致病基因的下調(diào)表達(dá)的能力或消除病原細(xì)胞 本身的效率的限制。相反地，所公開(kāi)的方法和組合物避免了許多與這些療法相關(guān)的最常見(jiàn) 缺點(diǎn)。由于靶向病原細(xì)胞中的特異性遺傳模板，所公開(kāi)的方法和組合物避免了脫靶毒性并 增強(qiáng)病原特異性反應(yīng)性。與免疫治療方案不同的是，本公開(kāi)利用病原細(xì)胞的獨(dú)特轉(zhuǎn)錄組來(lái) 生成可以介導(dǎo)所需結(jié)果的新型分子。這些細(xì)胞因此被靶定用于定向干預(yù)，例如通過(guò)自毀或 其它細(xì)胞的免疫治療毀滅，而不引起對(duì)正常細(xì)胞的毒性。
[0041] 核酸模板化裝配
[0042] 本公開(kāi)允許在特定核酸序列的存在下選擇性產(chǎn)生所需化學(xué)結(jié)構(gòu)，即使在其它生物 材料的存在下仍是如此。本公開(kāi)描述了兩個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)物在靶核酸上的模板化裝配，這 產(chǎn)生其中存在靶核酸的活性效應(yīng)物產(chǎn)物。核酸模板化裝配通過(guò)當(dāng)存在靶核酸時(shí)增加相應(yīng)反 應(yīng)物的局部有效濃度改善反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，并且還可以通過(guò)正確地定位反應(yīng)物以參與反應(yīng)來(lái)降 低針對(duì)產(chǎn)物形成的活化障礙。本公開(kāi)允許通過(guò)僅在存在靶核酸處產(chǎn)生活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)來(lái)靶 向治療疾病例如癌癥和免疫系統(tǒng)紊亂。
[0043] 核酸模板化裝配的基本方案描繪如下：
[0044]
[0045]核酸模板化裝配使得兩個(gè)或更多個(gè)模板化裝配反應(yīng)物接近以產(chǎn)生模板化裝配連 接產(chǎn)物。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"模板化裝配連接產(chǎn)物"是指由一個(gè)或多個(gè)核酸模板化裝配反 應(yīng)物的相互作用、結(jié)合或反應(yīng)所形成的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。模板化裝配連接產(chǎn)物可以包括能夠產(chǎn)生 所需生物活性的活性效應(yīng)物產(chǎn)物。通過(guò)個(gè)別模板化裝配反應(yīng)物以位置特異性和/或方向特 異性方式經(jīng)由與靶核酸的結(jié)合相互作用例如雜交和退火來(lái)促進(jìn)模板化裝配連接產(chǎn)物形成。 在單一靶模板上靠近以參與模板化裝配反應(yīng)的模板化裝配反應(yīng)物在本文中被稱為"一組相 應(yīng)的反應(yīng)物"或"相應(yīng)的模板化裝配反應(yīng)物"。一組相應(yīng)的模板化裝配反應(yīng)物以序列特異性 方式結(jié)合至核酸靶模板的空間上接近的部分，并且容易地相互反應(yīng)以生成包含活性效應(yīng)物 結(jié)構(gòu)的模板化裝配連接產(chǎn)物。
[0046]模板化裝配反應(yīng)物可以包括核酸識(shí)別部分以引導(dǎo)序列特異性結(jié)合至靶模板的空 間上接近相應(yīng)反應(yīng)物的位置。模板化裝配反應(yīng)物還可以包括選擇性反應(yīng)性部分，以使得一 組相應(yīng)反應(yīng)物的選擇性反應(yīng)性部分容易地參與相互的反應(yīng)，但可以不容易與病原細(xì)胞或生 物樣本中的其它化合物反應(yīng)。與不允許反應(yīng)在復(fù)雜環(huán)境例如活細(xì)胞中進(jìn)行的其它模板化裝 配系統(tǒng)不同，利用選擇性反應(yīng)性部分可以允許核酸模板化裝配在高度復(fù)雜的化學(xué)環(huán)境包括 活細(xì)胞中進(jìn)行。模板化裝配反應(yīng)物還可以包括效應(yīng)物局部部分，這使得當(dāng)一組相應(yīng)的反應(yīng) 物參與靶模板化反應(yīng)時(shí)，可以產(chǎn)生活性效應(yīng)物產(chǎn)物。效應(yīng)物局部部分可以包括核酸識(shí)別部 分和選擇性反應(yīng)性部分的一些或全部。模板化裝配反應(yīng)物可以任選地包括化學(xué)連接子或附 屬基團(tuán)，它們可以促進(jìn)反應(yīng)物的合成、改善其化學(xué)或生物性質(zhì)和/或?qū)㈩~外的官能性引入 反應(yīng)物中。
[0047]本文所公開(kāi)的模板化裝配方法的實(shí)踐優(yōu)點(diǎn)的一個(gè)實(shí)例為分子的固有模塊性。例 如，如果由于效應(yīng)物局部部分裝配成完整效應(yīng)物分子而可以產(chǎn)生特別有效的效應(yīng)物分子， 則還可以通過(guò)在各種不同的核酸標(biāo)靶上進(jìn)行模板化而產(chǎn)生相同的效應(yīng)物分子。這可以通過(guò) 使連接至選擇性反應(yīng)性基團(tuán)的相同效應(yīng)物局部結(jié)構(gòu)結(jié)合至不同的核酸識(shí)別部分而實(shí)現(xiàn)，所 述核酸識(shí)別部分與指定靶核酸的結(jié)合使得所述選擇性反應(yīng)性基團(tuán)在空間上接近。通過(guò)這 種方式，完整效應(yīng)物分子可以通過(guò)結(jié)合至核酸標(biāo)靶來(lái)裝配，以產(chǎn)生相同的最終生物作用。另 外，可以革巴定相同細(xì)胞內(nèi)的若干不同的轉(zhuǎn)錄物以避免由于單一特定革巴轉(zhuǎn)錄物的可能損失或 后天不可接近性所導(dǎo)致的模板化失敗。因此，相同的效應(yīng)物產(chǎn)物分子可以在相同靶細(xì)胞內(nèi) 的不同核酸標(biāo)靶上合成。類似地，可以在相同的轉(zhuǎn)錄物上裝配不同的效應(yīng)物產(chǎn)物以避免對(duì) 可以在靶細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的任何給定效應(yīng)物機(jī)制的可能抗性。因此，通過(guò)識(shí)別病原細(xì)胞內(nèi)的各 種靶轉(zhuǎn)錄物，可以使用相同的效應(yīng)物裝配物來(lái)消除細(xì)胞或在相同的轉(zhuǎn)錄物上裝配不同的效 應(yīng)物產(chǎn)物。這種模塊性的優(yōu)點(diǎn)為模板化裝配技術(shù)提供了在現(xiàn)有生物治療干預(yù)中未見(jiàn)到的靈 活性。
[0048] 在一些實(shí)施方案中，一組相應(yīng)的模板化裝配反應(yīng)物是由為兩種或更多種不同化合 物的模板化裝配反應(yīng)物組成，如圖1A和圖1B中所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一組相應(yīng)的模 板化裝配反應(yīng)物可以由化學(xué)連接子連接，連接方式為相應(yīng)的反應(yīng)物可以物理連接但維持空 間分離，除非存在靶模板以使它們接近來(lái)用于模板化裝配反應(yīng)，如圖1C中所示。
[0049] 本公開(kāi)總體上描述模板化裝配反應(yīng)物的方法和組合物，所述反應(yīng)物包含至少一個(gè) 核酸識(shí)別部分、至少一個(gè)選擇性反應(yīng)性部分和至少一個(gè)效應(yīng)物局部部分。
[0050] 本公開(kāi)進(jìn)一步描述了施用一組相應(yīng)的模板化裝配反應(yīng)物以在靶核酸模板的存在 下產(chǎn)生活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)的方法。還描述了能夠產(chǎn)生所需生物活性的示例性活性效應(yīng)物結(jié) 構(gòu)。
[0051] -般方法描繪于圖2A中，且模板化裝配產(chǎn)物的實(shí)例示于圖2B和圖2C中。所述方 法和組合物的進(jìn)一步細(xì)節(jié)描述于以下部分中。
[0052] 核酸模板化裝配反應(yīng)物的設(shè)計(jì)和合成
[0053] 為了在靶細(xì)胞中選擇性產(chǎn)生所需活性，需要合成這樣的模板化裝配反應(yīng)物化合 物，其：a)在靶核酸的存在下，生成產(chǎn)生所需活性的活性效應(yīng)物產(chǎn)物；b)在不存在靶核酸時(shí) 不生成活性效應(yīng)物產(chǎn)物或明顯量的活性；以及c)在天然生物分子的存在下不被非生產(chǎn)性 副反應(yīng)耗盡。具有這些性質(zhì)的模板化裝配反應(yīng)物化合物可以通過(guò)實(shí)施以下步驟來(lái)合成，其 中可以改變這些步驟的順序以適應(yīng)特定情況：
[0054] ?識(shí)別病原細(xì)胞或樣本材料中的合適的靶核酸模板。
[0055] ?確定可以在病原細(xì)胞或樣本材料中產(chǎn)生所需作用的合適的活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)。
[0056] ?確定模板化策略。
[0057] ?設(shè)計(jì)和合成可以結(jié)合靶核酸模板的核酸識(shí)別部分。
[0058] ?設(shè)計(jì)和合成與產(chǎn)生合適的活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)相容的選擇性反應(yīng)性部分。
[0059] ?設(shè)計(jì)和合成與產(chǎn)生合適的活性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)相容的效應(yīng)物局部部分。
[0060] ?合成完整的核酸模板化裝配反應(yīng)物。
[0061] 圖3描繪了模板化裝配反應(yīng)物合成方法的步驟的流程圖。這些步驟中的每一個(gè)的 細(xì)節(jié)描述于以下部分中。
[0062] 靶核酸
[0063] 任何核酸都可以是用于核酸模板化裝配的可能的靶核酸，條件是至少一些序列信 息是可用的，足以直接或間接結(jié)合核酸識(shí)別部分。核酸識(shí)別部分單元的一些非限制性實(shí)例 可以包括寡核苷酸、肽核酸寡聚物和嗎啉代寡聚物。靶核酸序列的一些非限制性實(shí)例可以 包括mRNA、基因組或細(xì)胞器DNA、附加體或質(zhì)粒DNA、病毒DNA或RNA、miRNA、rRNA、snRNA、 tRNA或任何其它的生物或人工核酸序列。
[0064] 在一些實(shí)施方案中，靶核酸可以存在于靶隔室中，而不存在于非靶隔室中。這個(gè) 實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)例包括存在于病原細(xì)胞或患病細(xì)胞中，而不存在于健康細(xì)胞中的核酸序 列。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"病原細(xì)胞"可以指能夠引起或促使患病或異常狀況的細(xì)胞，例如 感染病毒的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和感染微生物的細(xì)胞。
[0065] 含有靶核酸的樣本的任何細(xì)胞、病毒、組織、空間區(qū)域、裂解物或其它子組分都可 以提供該靶核酸。含有靶核酸的靶隔室可以包括但不限于病原細(xì)胞、癌細(xì)胞、病毒、被病毒 或其它病原體感染的宿主細(xì)胞或有助于自體免疫性的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞例如適應(yīng)性或先天 免疫系統(tǒng)、移植排斥或過(guò)敏反應(yīng)的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶核酸可以存在于病毒或感 染病毒的細(xì)胞中，而不存在于健康細(xì)胞中。病毒的一些非限制性實(shí)例可以包括DNA病毒、 RNA病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶核酸可以存在于腫瘤或癌性細(xì)胞中，而不存 在于健康細(xì)胞中。癌癥的一些非限制性實(shí)例可以包括由致癌病毒例如人類乳頭狀瘤病毒、 Epstein-Barr病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒、Merkel細(xì)胞多瘤病毒和 卡波西氏肉瘤（Kaposi'ssarcoma)相關(guān)皰疹病毒所引起的癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，革巴 核酸可以存在于感染原或微生物中或被感染原或微生物感染的細(xì)胞中，而不存在于健康細(xì) 胞中。感染原或微生物的一些非限制性實(shí)例可以包括病毒、細(xì)菌、真菌、原生生物、朊病毒或 真核寄生蟲(chóng)。
[0066] 靶核酸序列還可以是基因例如致癌基因、突變基因、致癌病毒基因、病毒核酸序 列、微生物核酸序列、差異表達(dá)基因和其核酸基因產(chǎn)物的片段、部分或局部。
[0067] 病毒特異性靶核酸的一些非限制性實(shí)例