一種轉(zhuǎn)基因植株dna的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是設(shè)及一種轉(zhuǎn)基因植株DNA的提取方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，擬南芥和煙草是最常用模式植物，在基因功能研究中起到舉足輕重的作用。 在轉(zhuǎn)基因工作中，經(jīng)常需要提取轉(zhuǎn)基因植株的DNA，比如轉(zhuǎn)基因鑒定、插入位點(diǎn)檢測、拷貝數(shù) 分析等。由于每個轉(zhuǎn)基因株系的插入位點(diǎn)和拷貝數(shù)存在差異，通常需要提取幾十株甚至幾 百株植株的DNA，工作量巨大。因此如何一次性獲得質(zhì)量好且量足夠的轉(zhuǎn)基因植株DNA，是 轉(zhuǎn)基因研究工作開展的前提。 陽00引常規(guī)擬南芥和煙草提取DNA的方法由W下兩種：SDS法和CTAB法。
[0004]SDS法，步驟如下：（1)取新鮮的擬南芥葉片2-3片加入2血的離屯、管中，加入 液氮，玻璃棒研碎；（2)研磨W后，加入600-700μL的提取液，混勻，然后在60°C下水浴 20-60min;(3)4°C下12OOOr/min離屯、lOmin;(4)取上清液至一新管，加入等體積的氯仿： 異戊醇（24 :1)，4°C下12 00化/min離屯、7min; (5)取上清液至一新管，加入70%體積的異 丙醇，混勻，4°(：下1200化/111111離屯、15111111;(6)棄上清，70%乙醇洗2次沉淀，吹干；（7)溶 于 20-30μL含有 0.Img/mLRNase的(1地2〇 中。 陽0化]CTAB法，步驟如下：（1)取一片大小為0. 5cmX2cm的新鮮葉子用液氮快速冷凍后 放置于1. 5mL的巧pendorf管中用末端燒溶合藍(lán)槍頭娠碎；（2)研磨W后，加入600μL的提 取液，顛倒離屯、管數(shù)次混勻，然后在65°C下水浴60min;做取出后加等體積的酪：氯仿：異 戊醇（25:24:1)抽提液，混勻，用E：ppendo;rf離屯、機(jī)于 4°C，10000;r/min離屯、5min。（4)將 上清液轉(zhuǎn)至新的離屯、管中，加入RNaseA至終濃度為1μg/mL，在37°C下放置30min。再加 入等體積的酪：氯仿：異戊醇（25:24:1)抽提液抽提一次，同樣用化pendorf離屯、機(jī)于4°C， 1000化/min離屯、5min; (5)將上清液轉(zhuǎn)至新的離屯、管中，用等體積的氯仿/異戊醇抽提一 次。將水相轉(zhuǎn)至新的離屯、管中，加入1/10體積3mol/L的NaAc(抑5. 2)，3倍體積的100% 乙醇后-70°(：放置8~12111111，沉淀0臟；（6)4°(：，10000以111111離屯、10111111。棄去上清液，用 70%乙醇洗涂DNA沉淀兩次；（7)放置于室溫驚干后，加入20μLTE緩沖液溶解DNA后保 存于-20°C用于PCR實(shí)驗(yàn)。
[0006] 上述兩種DNA的提取方法主要存在的缺陷或不足之處為：
[0007] (1)現(xiàn)行方法存在使用大量有毒試劑的問題，比如β-琉基乙醇、異戊醇和飽和 酪，運(yùn)些試劑均有毒且發(fā)出難聞的氣味，對實(shí)驗(yàn)操作者帶來風(fēng)險，并且容易污染環(huán)境。
[0008] (2)直接在1. 5血或2血的巧pendorf管中利用槍頭對樣品進(jìn)行研磨，通常研磨不 充分，容易導(dǎo)致DNA提取失敗，并且不適合大規(guī)模轉(zhuǎn)基因樣品DNA的提取。
[0009] (3)DNA提取率低，難W滿足多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測的需要。
[0010] 公開于該【背景技術(shù)】部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng) 當(dāng)被視為承認(rèn)或W任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 針對現(xiàn)有擬南芥和煙草提取DM的方法的不足，本發(fā)明的目的是提供一種適合于 大規(guī)模轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草DNA的提取方法。 陽012]本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0013] 一種轉(zhuǎn)基因植株DNA的提取方法，包括W下步驟：
[0014] (1)先將2%CTAB提取液置于65°C水浴鍋中預(yù)熱，在使用前搖勻；
[0015] (2)取轉(zhuǎn)基因煙草或擬南芥葉片l-2g置于研鉢中，向研鉢中加入預(yù)熱后的CTAB提 取液2. 4mU再加入l-2g石英砂，將其研磨成勻漿液，得到勻漿液；
[0016] 做吸取1. 0血勻漿液加入到2血離屯、管中，置于65°C水浴比，每20min輕搖1 次；
[0017] (4)待水浴結(jié)束后取出離屯、管，向每管勻漿液中加入0. 6mL氯仿，混勻，然后將離 屯、管在常溫、轉(zhuǎn)速為lOOOOr/min下離屯、8min;
[0018] (5)吸取離屯、管中的上清液0. 7血加入到另一個新的2血離屯、管中，再加入0. 5血 的異丙醇，混勻，于-20°C沉淀20min，在常溫、轉(zhuǎn)速為1000化/min下離屯、8min;
[0019] (6)去除上清，用ImL70%的酒精洗涂沉淀1次，移除酒精，然后在常溫、轉(zhuǎn)速為 100(K)r/min下離屯、Imin，再用移液槍吸取離屯、管中剩余的酒精，在室溫下放置5-lOmin;
[0020] (7)往離屯、管中加入200μL的TE緩沖液溶解沉淀，搖勻，使之溶解完全，所得溶液 即為轉(zhuǎn)基因煙草或擬南芥DNA提取液，將其置于-20°C下保存，備用。 陽021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0022] (1)本方案提取液中不用有毒難聞的試劑β-琉基乙醇，并且在提取的過程中也 不用有毒難聞的藥品異戊醇和酪，減少實(shí)驗(yàn)對操作者和環(huán)境的影響。
[0023] (2)樣品研磨采用石英砂巧.4ml提取液+轉(zhuǎn)基因植物葉片共同研磨成勻漿的方 式，可W保證每個樣品研磨充分（加入大體積的提取液體2. 4ml，是為了更好的勻漿，加入 石英砂是為了增加摩擦系數(shù)），并且適合于大批量、大規(guī)模提取轉(zhuǎn)基因植株DNA。
[0024] (3)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟，本方案只用氯仿抽提一次即可，不用有毒且難聞的酪和異戊 醇，減少有毒試劑的使用量，降低對環(huán)境的污染。
[00巧](4)研磨后吸取勻漿液1ml，而不是常用方法中的600μ以主要是為了增加樣品的 量，便于提取更多的DNA，每20min輕搖一次，主要是為了讓提取液在水浴過程中與樣品的 充分混勻。 陽0%] (5)加氯仿離屯、后，吸取上清液最多0. 7ml，吸取時盡量遠(yuǎn)離中間層，減少蛋白質(zhì) 的污染。
[0027] (6)采用0. 7倍體積的異丙醇在-20°C條件下沉淀DNA，20分鐘即可，可W縮短實(shí) 驗(yàn)操作的時間。
[0028] (7)用酒精洗涂DNA沉淀后，采用再次離屯、Imin的方式將殘留酒精完全離屯、到管 底，利用移液槍將其移除，可W加快DNA沉淀中酒精的揮發(fā)，節(jié)省實(shí)驗(yàn)操作時間。
[0029] 做200μL的TE緩沖液溶解沉淀，而不是常規(guī)方法中的20-30μL溶解沉淀，可W 充分溶解DNA。
[0030] (9)本方案提取過程中不用液氮，降低實(shí)驗(yàn)成本。
[0031] (10)本實(shí)驗(yàn)方案中，全部采用常溫離屯、，離屯、速度定為100(K)r/min，降低DM提取 對實(shí)驗(yàn)條件的限制，并有助于能耗的降低。
【附圖說明】 陽03引圖1為本發(fā)明方法提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0033] 有關(guān)附圖標(biāo)記的說明：
[0034] A-提取擬南芥DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；B-提取煙草DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保 護(hù)范圍并不受【具體實(shí)施方式】的限制。
[0036] 除非另有其它明確表示，否則在整個說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語"包括"或其變 換如"包含"或"包括有"等等將被理解為包括所陳述的元件或組成部分，而并未排除其它 元件或其它組成部分。
[0037] 連施例1:本發(fā)巧轉(zhuǎn)基因植株DNA的提取方法(分別提取轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草各2 株）
[0038] 1. 1主要試劑：提取液2 % CTAB，lOOmmol/L Tris-肥1 (抑8. 0)，1. 4mol/L NaCl， lOmmol/L邸ΤΑ ;其他試劑：異丙醇、氯仿、TE緩沖液。
[0039] 1. 2主要儀器：移液槍、離屯、機(jī)、水浴鍋、冰箱、電泳系統(tǒng)、美國quawellQ3000超微 量紫外分光光度計等。
[0040] 1. 3提取方法包括如下步驟：
[0041] (1)先將2%CTAB提取液置于65°C水浴鍋中預(yù)熱，在使用前搖勻；