多糖多酚植物基因組的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種應(yīng)用于植物基因組提取的方法。
【背景技術(shù)】 陽〇〇引基因組DNA的提取技術(shù)是遺傳學(xué)與分子生物學(xué)研究中的基本技術(shù)。DNA提取是分 子分析的重要步驟，在得到基于凝膠系統(tǒng)的高分辨率結(jié)果方面起著重要作用，高質(zhì)量的DNA 是獲得準(zhǔn)確試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)。
[0003] 現(xiàn)有多種DNA提取方法，如CTAB法、高鹽低抑法、SDS法、苯酪法和提取試劑盒的 使用等。但是，對(duì)于多數(shù)葉厚汁多、含有大量多糖類和其他次生代謝產(chǎn)物的植物來說，采用 常規(guī)的方法很難提取出高質(zhì)量的DNA，因而需要改良常規(guī)的分離方法。
[0004] CTAB是一種去污劑，可破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，并能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液 中是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度時(shí)，從溶液中沉淀，通過離屯、，可將CTAB--核酸 復(fù)合物同蛋白質(zhì)、部分多糖類物質(zhì)分開。溶解于高鹽溶液中的CTAB--核酸復(fù)合物，加入乙 醇可使核酸沉淀，而CTAB則溶于乙醇。CTAB法是目前應(yīng)用最廣泛發(fā)展較成熟的方法，最大 優(yōu)點(diǎn)就是除去多糖。在CTAB法的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)?shù)母牧?，獲得了高質(zhì)量的DNA分子。細(xì)菌 一般分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌和真菌的基因組提取一直困擾著科 研人員。目前提取微生物基因組的方法主要有酶解法、化學(xué)或者熱裂解法、磁珠或超聲波機(jī) 械破壁，又或者是上述幾種方法的結(jié)合。但運(yùn)些方法提取出的基因組濃度很低，且大多污染 嚴(yán)重，不能滿足Ξ代測(cè)序的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的在于提供一種改進(jìn)的多糖多酪植物DNA提取方法，從而對(duì)富含多糖 多酪植物材料的基因組實(shí)現(xiàn)快速高效的獲取。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實(shí)施方式提供了一種多糖多酪植物基因組的提取 方法，包含下述步驟：（1)取待提取植物材料，研磨后加入核酸分離緩沖液和2-琉基乙醇， 并使所述2-琉基乙醇的終濃度為1 %~5 %，震蕩混勻后，置于75~95度水浴中5~30分 鐘；似從水浴中取出后，離屯、機(jī)中高速離心棄掉上清液；做加入1XPBS溶液，研磨儀上 震蕩混勻，高速離屯、，棄上清；(4)向沉淀中加入500~lOOOul預(yù)熱3XCTAB裂解液并混勻， 65度水浴裂解30~60分鐘；(5)加等體積的酪/氯仿/異戊醇混合液，混勻，離屯、；(6)取 上清，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，混勻，離屯、；（7)取上清，加入化C1和冰異丙醇， 上下顛倒混勻，在-20~-80度環(huán)境下沉淀1~3小時(shí)；（8)取出，離屯、后，將沉淀用乙醇洗 涂，風(fēng)干后加TE溶解，即得到所提取的基因組。
[0007] 本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的多糖多酪植物基因組的提取方法，其創(chuàng)新點(diǎn)在于：一 方面，在核酸分離緩沖液中適當(dāng)提高2-琉基乙醇的濃度，能有效的去除多酪W及代謝物 質(zhì)，能降低后續(xù)裂解多酪物質(zhì)多提取的影響；另一方面，使用IxPBS緩沖液清洗并研磨分離 后的細(xì)胞沉淀，能有效去除多糖，減少后續(xù)多糖對(duì)提取的影響；再一方面，增加CTAB的濃度 至3%，能更有效的去除多糖。因而，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的多糖多酪植物基因組的提 取方法，能有效去除多糖多酪，減少糖和酪類物質(zhì)對(duì)核酸提取的影響，提高DNA的質(zhì)量和濃 度；且本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的基因組提取方法耗時(shí)短，成本低廉，相較試劑盒，能節(jié)約 成本，提高濃度，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。
[0008] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的多糖多酪植物基因組的提取方法中，步驟（1) 中的核酸分離緩沖液中包含下述組分：200mM化is、250mM化cl、50mM邸TA和質(zhì)量濃度為 4%PVP，提高了核酸分離緩沖液中PVP的濃度，能有效地去除多酪W及代謝物質(zhì)，能降低后 續(xù)裂解多酪物質(zhì)多提取的影響。
[0009] 優(yōu)選地地，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的多糖多酪植物基因組的提取方法中，步驟 (1)中對(duì)待提取植物材料研磨之前，W液氮將所述待提取植物材料凍存。
[0010] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的多糖多酪植物基因組的提取方法中，步驟（1) 中加入核酸分離緩沖液時(shí)，每100毫克待提取植物材料加入1~2毫升核酸分離緩沖液。
[0011] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的多糖多酪植物基因組的提取方法中，在進(jìn)行 步驟（4)之前，對(duì)步驟做重復(fù)2~3次。
[0012] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的多糖多酪植物基因組的提取方法中，步驟巧） 中所述的酪/氯仿/異戊醇混合液中，按體積比計(jì)，酪：氯仿：異戊醇為25:24:1 ;步驟化） 中的氯仿/異戊醇混合液中，按體積比計(jì)，氯仿：異戊醇為24:1。上述提取試劑中，酪使蛋 白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了raase的降解作用；氯仿可加速有機(jī)相與液相的分層。在抽提DNA的 過程中，為了混合均勻，通常進(jìn)行劇烈震蕩，此時(shí)會(huì)在混合液內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡，而異戊醇的 作用是降低分子表面張力，因而能在提取過程中減少氣泡的產(chǎn)生。為使酪、氯仿和異戊醇在 DNA提取過程中更好地發(fā)揮上述作用，步驟巧）中所使用的酪/氯仿/異戊醇混合液中，按 體積比計(jì)，酪：氯仿：異戊醇為25:24:1 ;步驟化）中使用的氯仿和異戊醇的最佳體積比為 24 :1。
[0013] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的多糖多酪植物基因組的提取方法中，步驟（7) 中，加入化C1的體積為所述上清體積的1/2 ;加入冰異丙醇的體積為所述上清體積的2/3。
【附圖說明】
[0014] 圖1為【具體實(shí)施方式】中樣本序號(hào)為1、2的多糖多酪植物樣本材料提取到的基因組 DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，其中，泳道號(hào)為樣本序號(hào)；
[0015] 圖2為【具體實(shí)施方式】中樣本序號(hào)為3、4的多糖多酪植物樣本材料提取到的基因組 DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，其中，泳道號(hào)為樣本序號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的各實(shí) 施方式進(jìn)行詳細(xì)的闡述。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可W理解，在本發(fā)明各實(shí)施方式中， 為了使讀者更好地理解本申請(qǐng)而提出了許多技術(shù)細(xì)節(jié)。但是，即使沒有運(yùn)些技術(shù)細(xì)節(jié)和基 于W下各實(shí)施方式的種種變化和修改，也可W實(shí)現(xiàn)本申請(qǐng)各權(quán)利要求所要求保護(hù)的技術(shù)方 案。