一種從黃鱔體表粘液提取基因組dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及黃鱔基因組DNA提取方法檢測，具體地說，涉及一種如何從黃鱔體表粘液提取基因組DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃鱔(Monopterus albus)是我國的一種重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一，屬于硬骨魚綱，合鰓目，合鰓科，黃鱔屬。受環(huán)境污染及濫捕的影響，黃鱔的自然資源量不斷下降，而人工養(yǎng)殖因受苗種繁殖的制約，尚難以形成規(guī)模，所以對黃鱔遺傳育種的研究一直是黃鱔主要方向。
[0003]隨著遺傳育種研究的不斷深入，從DNA水平分析黃鱔遺傳多樣性及優(yōu)良性狀相關(guān)的分子標(biāo)記尋找已成為熱點(diǎn)?；蚪MDNA的提取是進(jìn)行研究的基本前提，取肌肉、肝臟等組織的方式難以使魚類存活下來。因此一些魚類可以通過采用鰭條或鱗片的方式來提取其DNA，從而可以保證魚類繼續(xù)存活。而體重大于100g的魚，從尾靜脈采血0.5mL也不會對魚的生存造成威脅。但是由于黃鱔即無鱗片，也無鰭條，抽取少量的血液后的黃鱔很快就會死亡。因此要想進(jìn)行黃鱔家系構(gòu)建，優(yōu)良性狀分子標(biāo)記尋找等，不僅要知道對親本基因型，而且還要求親本能夠存活下來，以便與子代的出現(xiàn)的某些性狀進(jìn)行比較。因此，尋找一種可以在黃鱔親本活著的情況下提取其DNA的方法對于黃鱔雜交育種工作就顯得尤為重要了。
[0004]為了保證能夠在黃鱔存活的情況下提取其DNA，本發(fā)明研究嘗試從黃鱔體表粘液中提取DNA，同時觀察采集粘液的后的黃鱔經(jīng)過一個月的飼養(yǎng)的死亡率。這就為研究黃鱔遺傳育種提供了重要方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述不足，本發(fā)明提供一種從黃鱔體表粘液提取基因組DNA的方法，本發(fā)明方法簡單、高效、便捷，且不會對黃鱔造成損傷，不影響其存活能力和生產(chǎn)性能。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]一種從黃鱔體表粘液提取基因組DNA的方法，包括以下步驟:
[0008]1)黃鱔體表粘液的采集:無創(chuàng)傷地從黃鱔體表采集體表粘液；
[0009]2)黃鱔體表粘液基因組DNA的提取。
[0010]優(yōu)選地，步驟1)包括用干凈的衛(wèi)生紙無創(chuàng)傷地擦拭黃鱔體表粘液，獲得黃鱔體表粘液基因組DNA樣品；
[0011]優(yōu)選地，步驟1)還包括將含有黃鱔粘液的衛(wèi)生紙剪碎放入滅菌離心管中加入無水乙醇(例如500微升)，保存于零下20度冰箱中；可以長久保存黃鱔體表粘液基因組DNA樣品，便于隨用隨??；
[0012]優(yōu)選地，步驟2)包括將黃鱔體表粘液基因組DNA樣品加入STE，用蛋白酶K消化，然后用苯酚和氯仿除去蛋白，用乙醇沉淀后，12000r/min離心沉淀DNA，棄上清，吹干沉淀，用雙蒸水溶解。
[0013]具體地，步驟2)包括將黃鱔體表粘液基因組DNA樣品適量，置于滅菌離心管中，加入STE500ul，再加入10ul的PK于55°C恒溫消化，至消化完為止；然后加入Tris飽和的酚(Phenol Staturated) 500ul，震蕩 5_6min，12000r/min 離心 lOmin，取上清液，再重復(fù)一次(即加入 Tris 飽和的酸 500ul，震蕩 5_6min，12000r/min 離心 lOmin)，
[0014]取上清液300ul，加入異丙醇300ul，震蕩，12000r/min離心lOmin，棄去上清液；加入無水乙醇lOOul，然后棄乙醇清洗，再重復(fù)一次(即加入無水乙醇lOOul，然后棄乙醇清洗)；加入無菌水50ul溶解，溶解后加入200ul乙醇，混勻，12000r/min離心lOmin ;棄上清液，陰干；然后加入雙蒸水30ul，即得含黃鱔體表粘液基因組DNA的溶液。
[0015]上述從黃鱔體表粘液中提取基因組DNA的方法，還包括用黃鱔actin基因引物檢測，驗(yàn)證是否為黃鱔基因組DNA。
[0016]本發(fā)明所述衛(wèi)生紙也可用吸水性能相近的紙巾紙、餐巾紙、紙手帕等代替；關(guān)于衛(wèi)生紙等的相關(guān)要求可參考國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T20808-2011紙巾紙》。
[0017]本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0018]1、本發(fā)明采用黃鱔體表粘液作為基因組DNA提取材料，對黃鱔機(jī)體不造成任何損傷；保護(hù)了取樣個體的組織完整性，通過不長的恢復(fù)期個體即可從應(yīng)激狀態(tài)中恢復(fù)過來，并可以長期多次取樣；
[0019]2、本發(fā)明方法將黃鱔體表粘液基因組DNA提取材料直接固定于無水乙醇中，方便保存；
[0020]3、本發(fā)明方法所提取的DNA能用于黃鱔基因指紋分析、親子鑒定、家系結(jié)構(gòu)組成等遺傳學(xué)和分子生物學(xué)應(yīng)用與基礎(chǔ)研究中，也為利用分子手段連續(xù)監(jiān)測特定個體的生長發(fā)育情況奠定了基礎(chǔ)。
[0021]4、本發(fā)明方法簡單、高效、便捷，且不會對黃鱔造成損傷，不影響其存活能力和生產(chǎn)性能。
【附圖說明】
[0022]圖1為實(shí)驗(yàn)例1中粘液DNA、肌肉DNA電泳結(jié)果圖，其中Μ為分子量為2000的Marker ;1、3、5為三組黃鱔的粘液DNA ;2、4、6分別為對應(yīng)三組黃鱔的肌肉DNA。
[0023]圖2為實(shí)驗(yàn)例2中粘液DNA、肌肉DNA actin引物擴(kuò)增后的檢測結(jié)果圖，Μ為分子量為2000的Marker ; 1、3、5為三組黃鱔的粘液DNA ; 2、4、6分別為對應(yīng)三組黃鱔的肌肉DNA。
[0024]圖3為實(shí)驗(yàn)例3中回收純化后粘液DAN、肌肉DNA的檢測結(jié)果圖，其中Μ為分子量為2000的Marker ;1為純化后收集的黃鱔的粘液DNA ;2、為純化后收集的黃鱔的肌肉DNA。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購買得到的常規(guī)產(chǎn)品。
[0026]本發(fā)明采用以下方法對黃鱔基因組DNA (黃鱔體表粘液基因組DNA、肌肉基因組DNA)進(jìn)行檢測:用超微量紫外分光光度計測定黃鱔基因組DNA溶液A260/A280比值和濃度，進(jìn)而來判斷提取得到的DNA溶液的質(zhì)量。然后用水平電泳檢測提取得到的粘液DNA溶液，觀察提取的粘液DNA溶液的完整性。
[0027]實(shí)施例1
[0028]一種從黃鱔體表粘液提取基因組DNA的方法，包括以下步驟:
[0029]1)黃錯體表粘液的米集:
[0030]將黃鱔取出，放置干凈容器內(nèi)，用鑷子撕取少量衛(wèi)生紙輕輕擦取黃鱔體表的少量粘液，然后將吸取粘液的衛(wèi)生紙剪碎轉(zhuǎn)移到2ml的滅菌離心管中。每組作三個重復(fù)。
[0031 ] 2)黃鱔體表粘液基因組DNA的提取
[0032]向含有黃鱔粘液的滅菌離心管中加入STE500ul，再加入10ul的PK于55°C恒溫消化，至消化完為止。然后加入Tris飽和的酸(Phenol Staturated) 500ul，震蕩5_6min，12000r/min離心lOmin，取上清液，再重復(fù)一次(即加入Tris飽和的酚500ul，震蕩5_6min，12000r/min離心lOmin)。取上清液300ul，加