可控的基因組修飾瘧原蟲、重組表達(dá)載體及構(gòu)建方法、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種可控的基因組修飾追原蟲、重組表達(dá) 載體及構(gòu)建方法、應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由追原蟲感染引起的追疾是全球Η大主要傳染性疾病之一。每年有數(shù)億人感染追 疾，逾百萬人因追疾死亡，其中多數(shù)是5歲W下的兒童。追疾難W有效控制和根除的主要原 因之一在于對(duì)其病原體一追原蟲的生物學(xué)復(fù)雜性了解有限。追原蟲具有復(fù)雜的生活史，其 生長(zhǎng)發(fā)育需要在雌性按蚊和人（或其他脊椎動(dòng)物）等宿主體內(nèi)完成；追原蟲在按蚊體內(nèi)進(jìn) 行有性繁殖，而在人或其他脊椎動(dòng)物宿主體內(nèi)則進(jìn)行無性繁殖。追原蟲在宿主體內(nèi)的發(fā)育 過程分為肝期（紅外期）和紅細(xì)胞內(nèi)期（紅內(nèi)期）。肝期追疾一般不表現(xiàn)出臨床癥狀，而追 疾感染的主要病理反應(yīng)是由紅內(nèi)期引發(fā)的。由肝細(xì)胞釋放出的紅外期裂殖子進(jìn)入血流侵入 紅細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行紅內(nèi)期增殖，蟲體增殖和釋放導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂，從破裂紅細(xì)胞釋出的裂殖子 侵入健康的紅細(xì)胞，周而復(fù)始，導(dǎo)致大量紅細(xì)胞被破壞，病人表現(xiàn)出嚴(yán)重的臨床癥狀。目前 追原蟲基因組測(cè)序工作已基本完成，因而大量已測(cè)序基因的功能有待闡明。人們對(duì)參與追 原蟲生活史各階段分化、發(fā)育和增殖過程中的重要基因及其調(diào)控還了解甚少。探明追原蟲 各種基因及其基因產(chǎn)物的具體功能對(duì)于開發(fā)有效追疾疫苗和發(fā)現(xiàn)抗追新藥物祀位具有重 要的意義。
[0003] 因此，拓展分析追原蟲基因功能的方法已成為追疾研究的熱點(diǎn)。通過生物芯片 技術(shù)與抑制性消減雜交技術(shù)（Suppressivesubhactivehybridization,SSH)等技術(shù) 結(jié)合生物信息學(xué)分析，可W篩選得到許多與追原蟲生長(zhǎng)，繁殖及其對(duì)宿主作用相關(guān)的基因 并預(yù)測(cè)其可能功能，但對(duì)于疫苗與新藥的開發(fā)尤為重要的是確證追原蟲重要基因的具體 功能。早期科學(xué)家用酶抑制分子研究酶蛋白的功能，但由于酶抑制物的低特異性W及應(yīng) 用范圍的局限性限制了送種方法的發(fā)展。隨著追原蟲基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)者可W 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行祀基因失活直接研究該基因功能。RNA干擾（RNAinterference, RNAi)與基因敲除（geneknockout)技術(shù)是目前在哺乳動(dòng)物應(yīng)用較多的基因失活方法， 然而，追原蟲基因組中缺少RNAi所需的重要元件，因而RNAi在追原蟲中的應(yīng)用仍存在困 難。基因敲除是研究基因功能的經(jīng)典遺傳學(xué)方法，但由于紅內(nèi)期追原蟲為單倍體，對(duì)紅內(nèi) 期追原蟲具有重要功能的基因被敲除后將會(huì)導(dǎo)致蟲體死亡而無法研究其功能，因此，建立 追原蟲基因條件性敲除技術(shù)將會(huì)極大地方便研究其基因功能。將基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)與 基因敲除結(jié)合起來是建立基因條件性敲除技術(shù)最有效的方法之一。另有研究通過化e/ loxP或Flp/FRT系統(tǒng)與基因敲除結(jié)合實(shí)現(xiàn)基因條件敲除，但送種基因條件敲除技術(shù)局限 于必須使用特異性或組織特異性啟動(dòng)子，并且送種條件性敲除在該特定期或特定組織內(nèi)發(fā) 生后是不可逆轉(zhuǎn)的，因此，對(duì)于大部分生長(zhǎng)期為單倍體的追原蟲，仍然存在重要基因缺失 后蟲體死亡或嚴(yán)重受損而不能進(jìn)行轉(zhuǎn)基因蟲篩選與克隆的難題，而對(duì)追原蟲各個(gè)生長(zhǎng)期 都起重要作用的基因更難W用送種方法進(jìn)行研究。動(dòng)物細(xì)胞中用到的基因誘導(dǎo)表達(dá)方式 常利用一些特殊的啟動(dòng)子，送些啟動(dòng)子在某些理化條件下可誘導(dǎo)啟動(dòng)，如熱休克蛋白啟動(dòng) 子可在高溫下被誘導(dǎo)、糖皮質(zhì)激素和重金屬反應(yīng)啟動(dòng)子等，送些基因表達(dá)誘導(dǎo)方式存在W 下缺陷：誘導(dǎo)表達(dá)特異性差，系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)時(shí)表達(dá)有泄漏，誘導(dǎo)劑本身有毒性對(duì)細(xì)胞 造成損傷等。1992年，Gossen等利用大腸桿菌化10轉(zhuǎn)座子的四環(huán)素抗性操縱子為基礎(chǔ) 構(gòu)建了可用于研究哺乳類動(dòng)物基因功能的四環(huán)素調(diào)控的tet-off基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。該 系統(tǒng)包括調(diào)節(jié)單元和應(yīng)答單元二部分。調(diào)節(jié)部分表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子（tTA)在四環(huán)素存 在的情況下不激活目的基因表達(dá)；而在四環(huán)素去除后，tTA可激活應(yīng)答單元中目的基因表 達(dá)。而后Gossen等對(duì)tet-off系統(tǒng)進(jìn)行了改造，構(gòu)建了受四環(huán)素調(diào)控的Tet-on基因誘 導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)在沒有誘導(dǎo)劑的條件下啟動(dòng)子不被激活，而在加入誘導(dǎo)劑后目的基因 高效表達(dá)。tet-on系統(tǒng)具有嚴(yán)密、高效、可控制性強(qiáng)和誘導(dǎo)速度快等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于基 因功能研究。但已廣泛用于真核生物的tet-on系統(tǒng)不適用于追原蟲，因?yàn)橄到y(tǒng)包含的調(diào) 節(jié)單元和應(yīng)答單元中的關(guān)鍵元件單純瘡疹病毒HSV蛋白化e巧essimplexvirusvirion proteinlG,VP16)和四環(huán)素應(yīng)答兀件（tetra巧cline-responsiveelement,TRE)在追 原蟲中不工作。許多與追原蟲種屬接近的原蟲類生物已成功應(yīng)用四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng) 調(diào)控基因表達(dá)：如布氏錐蟲（WirtzE.等，Science, 1995,268:1179-1183)、阿米己原蟲 (HamannL.等，Mol.Biochem.Parasitol. 1997,84:83-91.)、利氏曼原蟲（YanS.等，Woods HoleMol.Parasitol.Meet, ,10th, 1999.)、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲（SunCH.等，Mol.Biochem. Parasitol. 2000, 105:51-60.)、弓形蟲（MeissnerM.等，Science, 2002, 298:837-840.) 等。然而，追原蟲的基因組富含AT堿基干擾對(duì)其基因啟動(dòng)子序列的分析，也給包含追原蟲 基因的質(zhì)粒載體在大腸桿菌的擴(kuò)增帶來麻煩；并且，追原蟲主要寄生于脊椎動(dòng)物和人的紅 細(xì)胞內(nèi)，外源性的DNA通過轉(zhuǎn)染整合到追原蟲基因組上需要經(jīng)過紅細(xì)胞膜、納蟲泡、蟲細(xì)胞 膜與核膜四層膜，轉(zhuǎn)染效率極低，送些都給追原蟲的基因修飾研究造成困難。近幾年，隨著 追原蟲核轉(zhuǎn)染技術(shù)的提高，追原蟲的基因修飾研究開始充滿活力。2005年，Meissner等構(gòu) 建的tet-off系統(tǒng)在人惡性追原蟲內(nèi)調(diào)控了綠色英光蛋白（GFP)基因表達(dá)（Proc.化tl. Acad.Sci.USA. 2005, 102(8) :2980-2985)，不過，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒并未整合到追原蟲基因組而W游 離體（episome)形式存在，而游離體容易丟失導(dǎo)致轉(zhuǎn)染結(jié)果不穩(wěn)定，受調(diào)控的基因誘導(dǎo)表 達(dá)率很低（約20%)且持續(xù)時(shí)間短暫，追原蟲內(nèi)源性基因保持完整無敲除。2012年底， PacoPino等建立tet-off系統(tǒng)條件性敲除PRF與NMT基因（CellHost&Microbe2012,12: 824 - 834.)。Tet-off在啟動(dòng)基因表達(dá)時(shí)受機(jī)體代謝誘導(dǎo)劑速度的影響，不及tet-on系統(tǒng) 啟動(dòng)基因表達(dá)快速、高效，而在關(guān)閉基因表達(dá)時(shí)tet-off系統(tǒng)需要持續(xù)給誘導(dǎo)劑，給基因功 能研究過程帶來不方便、對(duì)追原蟲及其宿主存在潛在的副作用W及實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能受干擾等 不利因素。并且，研制開發(fā)可控的基因組修飾追原蟲全蟲疫苗，只能選擇tet-on系統(tǒng)不可 用tet-off系統(tǒng)，因?yàn)闄C(jī)體給予疫苗后不能同時(shí)給予四環(huán)素來致弱追原蟲。追原蟲基因的 AT含量非常高；另外還具有許多與其它真核生物不一樣的基因特征，比如在多數(shù)真核細(xì)胞 內(nèi)可W工作的CMV啟動(dòng)子與SV40啟動(dòng)子在追原蟲細(xì)胞內(nèi)不起作用，追原蟲基因的啟動(dòng)子也 常常缺少真正的TATA盒，追原蟲基因啟動(dòng)子常有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，送些都為追原蟲基因 組的研究工作的開展增加了困難。
[0004] 此外，有效的抗追疾疫苗是人類控制追疾的重要手段。過去50年中，各國(guó)研究者 曾嘗試多種方案研發(fā)追疾疫苗，但至今仍未獲得可用于臨床的有效疫苗。早期研究表明，用 放射線照射減毒的子抱子免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人，能夠誘導(dǎo)出清除性的免疫保護(hù)力。但是送種 放射線減毒子抱子難W大量制備和生產(chǎn)，因而其全蟲無法作為疫苗在人類大規(guī)模接種，并 且放射線減毒的方法難W控制其質(zhì)量。上個(gè)世紀(jì)80年代，分子克隆技術(shù)的建立使人們將追 疾疫苗的研發(fā)寄希望于亞單位疫苗。過去40年中已發(fā)現(xiàn)和鑒定了數(shù)十種追疾疫苗候選抗 原，送些抗原與各種疫苗載體或佐劑配合設(shè)計(jì)了多種不同的亞單位疫苗方案。大量的測(cè)試 表明，追疾亞單位疫苗普遍保護(hù)效力低。由于追原蟲具有復(fù)雜的生活史，而且其抗原具有多 形性和變異性，目前追疾疫苗研究領(lǐng)域的許多學(xué)者認(rèn)為，基于一種或幾種抗原的亞單位追 疾疫苗可能很難誘導(dǎo)具有臨床意義的免疫力。為此，近年來研究的注意力集中到全蟲疫苗。 超低劑量紅內(nèi)期追原蟲多次接種感染機(jī)體可誘導(dǎo)很強(qiáng)的免疫保護(hù)力。但送種疫苗的明顯缺 點(diǎn)是可能會(huì)引發(fā)感染，特別是在免疫功能低下或受損的個(gè)體。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步、 追原蟲基因組序列測(cè)定W及追原蟲轉(zhuǎn)染與基因敲除技術(shù)的建立，通過敲除追原蟲某些與分 化發(fā)育相關(guān)的重要基因而使追原蟲遺傳滅活制備全蟲疫苗成為可能，近來有基因敲除的子 抱子感染動(dòng)物后可W誘導(dǎo)清除性免疫保護(hù)力的報(bào)道。然而，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要的基因被 敲除的追原蟲由于為缺陷蟲株不能正常生長(zhǎng)發(fā)育帶來難W大量生產(chǎn)的問題，并且與放射線 減毒的子抱子疫苗類似，存在子抱子難W大量生產(chǎn)、純化和儲(chǔ)存等方面的問題，并且一旦有 少量子抱子逃過針對(duì)肝期的免疫力侵入血液紅細(xì)胞就將進(jìn)入追原蟲致病的重要階段從而 導(dǎo)致疫苗保護(hù)失敗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此，針對(duì)上述技術(shù)問題，有必要提供一種可控的基因組修飾追原蟲、重組表達(dá) 載體及構(gòu)建方法、應(yīng)用，W用于追原蟲基因功能和疫苗的研究。
[0006] -種重組表達(dá)載體，其特征在于，包括長(zhǎng)同源臂和短同源臂W及位于所述長(zhǎng)同源 臂與所述短同源臂之間的四環(huán)素阻遏蛋白基因表達(dá)框、己胺嚼巧抗性基因表達(dá)框W及目的 基因表達(dá)框；其中，所述目的基因表達(dá)框中含有目的基因啟動(dòng)子W及目的基因；所述目的 基因啟動(dòng)子在多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處插入有四環(huán)素操縱基因序列；所述目的基因選自追原蟲 基因組中功能基因編碼序列中的一種；所述長(zhǎng)同源臂與短同源臂的序列為追原蟲基因組中 與所述功能基因?qū)?yīng)的DNA序列。
[0007] -種重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0008] 擴(kuò)增四環(huán)素阻遏蛋白的表達(dá)序列，并插入到含有己胺嚼巧抗性基因表達(dá)框的質(zhì)粒 載體中，得到含有四環(huán)素阻遏蛋白基因表達(dá)框及己胺嚼巧抗性基因表達(dá)框的質(zhì)粒A;
[0009] 在所述質(zhì)粒A的四環(huán)素阻遏蛋白基因表達(dá)框的3'端插入目的基因的長(zhǎng)同源臂，得 到質(zhì)粒B;
[0010] 合成在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處插入有四環(huán)素操縱基因序列的修飾后的啟動(dòng)子，并將該修 飾后的啟動(dòng)子插入到已消除多克隆酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒載體上，得到質(zhì)粒C，其中，所述修飾后 的啟動(dòng)子是在eflαa啟動(dòng)子片段的-205位點(diǎn)、-184位點(diǎn)W及-163位點(diǎn)中的至少一個(gè)位點(diǎn) 處插入有所述四環(huán)素操縱基因序列，所述eflαa啟動(dòng)子片段的序列如SEQIDNo.9所示；