凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種體外診斷試劑盒及其制備方法，用于人血漿標(biāo)本凝血酶原時(shí)間的 測(cè)定。更具體地，是一種利用組織因子醋化物制備的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒及其制備方 法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)凝血實(shí)驗(yàn)，即凝血常規(guī)四項(xiàng)包括凝血酶原時(shí)間測(cè)定（PT)、部 分活化凝血活酶時(shí)間測(cè)定（APTT)、凝血酶時(shí)間測(cè)定（TT)、纖維蛋白原濃度測(cè)定（FIB)，主要 用于出血性疾病的篩查與診斷、血栓性疾病與血栓前狀態(tài)檢查、各種抗凝治療監(jiān)測(cè)W及手 術(shù)前檢查。其中，PT為反應(yīng)機(jī)體外源性凝血途徑的主要檢測(cè)指標(biāo)，常用于：1血液凝固異常 可疑包括凝血酶原復(fù)合物多個(gè)因子（II、VII、X)，因子V，纖維蛋白原及去纖維蛋白原血癥 的篩選實(shí)驗(yàn)；2監(jiān)測(cè)及調(diào)整維生素K括抗劑，香豆素誘導(dǎo)劑的治療；3監(jiān)測(cè)維生素K缺乏及肝 臟疾??；4術(shù)前篩選可能的止血異常疾病。
[0003] 目前PT的臨床檢測(cè)多采用如ick法，其原理為在缺乏血小板的血漿內(nèi)加入組織 促凝血酶原激酶（組織因子）和Ca2+后凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，通過(guò)產(chǎn)生的凝血酶使纖 維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。PT測(cè)定結(jié)果報(bào)告方式有Ξ種：秒值、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算的百 分活度，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率（internationalnormalizedratioINR)。PT測(cè)定結(jié)果受眾多 因素的影響，其中凝血酶原試劑為最重要的影響因素。商品化的組織因子在敏感性上與 WK)推薦的有所不同，因此生產(chǎn)商需要對(duì)每批試劑確定一個(gè)敏感因子，此即國(guó)際敏感指數(shù) ISI(internationalsensitivityindex)，它用來(lái)表示試劑中組織凝血活酶相對(duì)活性的指 數(shù)。不同來(lái)源的組織凝血活酶對(duì)凝血因子的敏感性不同，為了使不同敏感性的組織凝血活 酶在PT檢測(cè)中得到同樣的結(jié)果，必須要制定一個(gè)共同遵循的敏感指標(biāo)。WHO先后制備或發(fā) 出了凝血活酶的多種國(guó)際參考品（IRP)，用已知ISI值的國(guó)際參考試劑與待測(cè)組織活酶試 劑檢測(cè)同一標(biāo)本，對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析，就可得出試劑的ISI數(shù)值。
[0004] 目前用于生產(chǎn)和出售的組織凝血活酶試劑必須標(biāo)有ISI數(shù)值。PT測(cè)定影響因素很 多，其中最關(guān)鍵的是凝血酶原試劑，由于所用凝血酶原試劑的敏感度不同，即使在相同條件 下對(duì)同一標(biāo)本測(cè)得的結(jié)果也不同，而我國(guó)醫(yī)生常用的凝血酶原百分活動(dòng)度則因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)血漿 不統(tǒng)一而相差更大，甚至達(dá)到難W比較的程度。因此WK)于1981年提出PT標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)告方 式為INR，INR= (PTR)ISI，其中ISI為國(guó)際敏感度指數(shù)，PTR為PT測(cè)定秒值（S)與PT標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)照秒值（S)的比值。經(jīng)上述公式換算成INR值后，能克服試劑之間敏感度差異的影響，使 INR值報(bào)告方式具有可比性和可信度。國(guó)內(nèi)多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)告人工屯、臟瓣膜置換術(shù)后采用國(guó)際 正常標(biāo)準(zhǔn)化比值對(duì)口服抗凝藥物治療的監(jiān)測(cè)，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，具有可比性。在口服抗凝藥 治療中，華法林類(lèi)藥物是非常有效的抗凝藥物，它在不同病人體內(nèi)的新陳代謝率不同，因而 它的劑量必須仔細(xì)監(jiān)測(cè)，否則就會(huì)因超劑量而造成出血或因?yàn)閯┝坎蛔銓?dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，血 栓形成。由此可見(jiàn)在凝血酶原時(shí)間的測(cè)定中，準(zhǔn)確的INR結(jié)果對(duì)臨床抗凝治療藥物的監(jiān)測(cè) 非常重要。但是不同ISI值的PT試劑測(cè)得的INR結(jié)果差異非常顯著，而且當(dāng)標(biāo)本的INR值 越高時(shí)，測(cè)定結(jié)果差異越顯著。理論上，ISI值越接近1. 0,表明試劑越敏感。 陽(yáng)〇化]但是由于實(shí)驗(yàn)室使用PT試劑質(zhì)量上的不同，使得同一個(gè)患者在不同醫(yī)院測(cè)定的 結(jié)果相差懸殊，造成檢測(cè)結(jié)果的不一致，影響對(duì)疾病的正確、及時(shí)診斷。因此，PT試劑的質(zhì) 量成了獲得準(zhǔn)確結(jié)果及診斷的關(guān)鍵。同時(shí)，由于試劑復(fù)溶后的穩(wěn)定性差，造成浪費(fèi)，導(dǎo)致醫(yī) 療單位成本增加，患者負(fù)擔(dān)加重，同時(shí)配制過(guò)程中的分裝、凍干等步驟也會(huì)導(dǎo)致試劑間的差 異，從而造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確，此外使用起來(lái)還需要復(fù)溶等步驟，造成操作過(guò)程的繁瑣。 所W研制一種安全、可靠、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng)、操作簡(jiǎn)便的PT試劑，對(duì)臨床診斷疾病來(lái) 說(shuō)是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服上述現(xiàn)有【背景技術(shù)】中的不足，本發(fā)明提供一種凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒 及其制備方法，該凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒通過(guò)含有多種有效成分的緩沖液體系與組織因 子醋化物的結(jié)合，保證了試劑的穩(wěn)定性，同時(shí)也免去了配制過(guò)程中的分裝和凍干等步驟，得 到準(zhǔn)確性、重復(fù)性及穩(wěn)定性等總體性能更好且操作更簡(jiǎn)便的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒，包括凝血酶原時(shí) 間測(cè)定試劑，所述凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑由緩沖液體系和溶解在所述緩沖液體系中的凝血 活酶組成，所述凝血活酶為組織因子醋化物，所述凝血活酶為組織因子醋化物，它在緩沖液 體系中的用量占緩沖液重量的0. 05~Iwt%;所述緩沖液體系各組分含量為：0. 05~3wt% 的牛血清白蛋白、6~20mM的氯化巧、20~200mM的緩沖劑、0. 05~0. 5wt%的疊氮化鋼、 0. 05~Iwt%的氯化鋼、其余為水，所述緩沖液體系的抑值為5. 0~8. 0,所述緩沖劑選自 于Tris-Hcl、MP0S、肥陽(yáng)S、TRICI肥、TAPS0、PBS。
[0008] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述組織因子醋化物在緩沖液體系中的用量占緩沖 液重量的0. 15~0. 3wt%。
[0009] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述牛血清白蛋白在緩沖液體系中的含量為1~ 2wt%。
[0010] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述氯化巧在緩沖液體系中的含量為9~15mM。
[0011] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述緩沖劑在緩沖液體系中的含量為30~45mM。
[0012] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述疊氮化鋼在緩沖液體系中的含量為0. 1~ 0. 15wt%。
[0013] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述氯化鋼在緩沖液體系中的含量為0. 1~ 0. 3wt%。
[0014] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述緩沖劑為MP0S、PBS體積比為1:2. 5的混合物。
[0015] 本發(fā)明還提供一種制備上述凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒的方法，包括如下步驟：（1) 按照不同配比配制緩沖液體系，將抑調(diào)至5. 0~8. 0,加入組織因子醋化物，攬拌混勻后得 到初始的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑；（2)將初始試劑在血凝儀上進(jìn)行質(zhì)控的測(cè)定，將質(zhì)控測(cè) 定結(jié)果調(diào)至符合該機(jī)型血凝儀配套質(zhì)控說(shuō)明書(shū)要求的范圍，測(cè)定結(jié)果最接近質(zhì)控平均值的 試劑配方確定為相應(yīng)機(jī)型最終的試劑配比；（3)W最終的試劑配比，按照步驟（1)的配制方 法即得凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：提供一種凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒及其制備方法，該凝血酶 原時(shí)間測(cè)定試劑盒免去了配制過(guò)程中的分裝和凍干等步驟，避免了因凍干和復(fù)溶過(guò)程造成 的試劑的瓶間差異，從而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果之間的較大差異。本發(fā)明試劑無(wú)需凍干，即可保證試 劑的穩(wěn)定性，確保了開(kāi)瓶后試劑的最優(yōu)有效性持續(xù)至少一個(gè)月，避免了實(shí)驗(yàn)結(jié)果間的較大 差異，同時(shí)節(jié)約了試劑的用量，開(kāi)瓶即用，操作起來(lái)更加快捷簡(jiǎn)便。
【具體實(shí)施方式】
[0017]W下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0018] 本發(fā)明的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒，包括凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑，凝血酶原時(shí)間 測(cè)定試劑由緩沖液體系和溶解在緩沖液體系中的凝血活酶組成，凝血活酶為組織因子醋化 物，它在緩沖液體系中的用量占緩沖液重量的0. 05~Iwt% ;緩沖液體系各組分含量為： 0. 05~3wt%的牛血清白蛋白、6~20mM的氯化巧、20~200mM的緩沖劑、0. 05~0. 5wt% 的疊氮化鋼、0. 05~Iwt%的氯化鋼、其余為水，緩沖液體系的抑值為5. 0~8. 0,緩沖劑選 自于Tris-Hcl、MP0S、肥陽(yáng)S、TRICI肥、TAPS0、PBS。使用本發(fā)明試劑盒時(shí)，待測(cè)血漿與凝血 酶原時(shí)間測(cè)定試劑用量的體積比為1:1. 9~2. 2。
[0019] 制備上述凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒的方法，包括如下步驟：（1)按照不同配比配 制緩沖液體系，將抑調(diào)至5. 0~8. 0,加入組織因子醋化物，攬拌混勻后得到初始的凝血酶 原時(shí)間測(cè)定試劑；（2)將初始試劑在血凝儀上進(jìn)行質(zhì)控的測(cè)定，將質(zhì)控測(cè)定結(jié)果調(diào)至符合 該機(jī)型血凝儀配套質(zhì)控說(shuō)明書(shū)要求的范圍，測(cè)定結(jié)果最接近質(zhì)控平均值的試劑配方確定為 相應(yīng)機(jī)型最終的試劑配比；（3)W最終的試劑配比，按照步驟（1)的配制方法即得凝血酶原 時(shí)間測(cè)定試劑盒。 陽(yáng)〇2〇] 實(shí)施例1
[0021] 凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒，包括凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑，凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑 由緩沖液體系和溶解在所述緩沖液體系中的凝血活酶組成，凝血活酶為組織因子醋化物， 組織因子醋化物在緩沖液體系中的用量占緩沖液重量的0. 05wt% ;緩沖液體系各組分含量 為：3wt%的牛血清白蛋白、20mM的氯化巧、20mM的肥陽(yáng)S、0. 5wt%的疊氮化鋼、0. 05wt%的 氯化鋼、其余為水，緩沖液體系的抑值為7. 0。