一種凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種體外診斷試劑盒及其制備方法，用于人血漿標(biāo)本凝血酶原時(shí)間的 測(cè)定。更具體地，是一種利用兔腦粉和組織因子醋化物制備的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒及 其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)凝血實(shí)驗(yàn)，即凝血常規(guī)四項(xiàng)包括凝血酶原時(shí)間測(cè)定（PT)、部 分活化凝血活酶時(shí)間測(cè)定（APTT)、凝血酶時(shí)間測(cè)定（TT)、纖維蛋白原濃度測(cè)定（FIB)，主要 用于出血性疾病的篩查與診斷、血栓性疾病與血栓前狀態(tài)檢查、各種抗凝治療監(jiān)測(cè)W及手 術(shù)前檢查。其中，PT為反應(yīng)機(jī)體外源性凝血途徑的主要檢測(cè)指標(biāo)，常用于：1血液凝固異常 可疑包括凝血酶原復(fù)合物多個(gè)因子（II、VII、X)，因子V，纖維蛋白原及去纖維蛋白原血癥 的篩選實(shí)驗(yàn)；2監(jiān)測(cè)及調(diào)整維生素K括抗劑，香豆素誘導(dǎo)劑的治療；3監(jiān)測(cè)維生素K缺乏及肝 臟疾??；4術(shù)前篩選可能的止血異常疾病。
[0003] 目前PT的臨床檢測(cè)多采用如ick法，其原理為在缺乏血小板的血漿內(nèi)加入組織 促凝血酶原激酶（組織因子）和Ca2+后凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，通過(guò)產(chǎn)生的凝血酶使纖 維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。PT測(cè)定結(jié)果報(bào)告方式有Ξ種：秒值、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的百 分活度，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率（internationalnormalizedratioINR)。PT測(cè)定結(jié)果受眾多 因素的影響，其中凝血酶原試劑為最重要的影響因素。商品化的組織因子在敏感性上與 WK)推薦的有所不同，因此生產(chǎn)商需要對(duì)每批試劑確定一個(gè)敏感因子，此即國(guó)際敏感指數(shù) ISI(internationalsensitivityindex)，它用來(lái)表示試劑中組織凝血活酶相對(duì)活性的指 數(shù)。不同來(lái)源的組織凝血活酶對(duì)凝血因子的敏感性不同，為了使不同敏感性的組織凝血活 酶在PT檢測(cè)中得到同樣的結(jié)果，必須要制定一個(gè)共同遵循的敏感指標(biāo)。WHO先后制備或發(fā) 出了凝血活酶的多種國(guó)際參考品（IRP)，用已知ISI值的國(guó)際參考試劑與待測(cè)組織活酶試 劑檢測(cè)同一標(biāo)本，對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析，就可得出試劑的ISI數(shù)值。
[0004]目前用于生產(chǎn)和出售的組織凝血活酶試劑必須標(biāo)有ISI數(shù)值。PT測(cè)定影響因素很 多，其中最關(guān)鍵的是凝血酶原試劑，由于所用凝血酶原試劑的敏感度不同，即使在相同條件 下對(duì)同一標(biāo)本測(cè)得的結(jié)果也不同，而我國(guó)醫(yī)生常用的凝血酶原百分活動(dòng)度則因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)血漿 不統(tǒng)一而相差更大，甚至達(dá)到難W比較的程度。因此WK)于1981年提出PT標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)告方 式為INR，INR= (PTR)ISI，其中ISI為國(guó)際敏感度指數(shù)，PTR為PT測(cè)定秒值（S)與PT標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)照秒值（S)的比值。經(jīng)上述公式換算成INR值后，能克服試劑之間敏感度差異的影響，使 INR值報(bào)告方式具有可比性和可信度。國(guó)內(nèi)多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)告人工屯、臟瓣膜置換術(shù)后采用國(guó)際 正常標(biāo)準(zhǔn)化比值對(duì)口服抗凝藥物治療的監(jiān)測(cè)，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，具有可比性。在口服抗凝藥 治療中，華法林類藥物是非常有效的抗凝藥物，它在不同病人體內(nèi)的新陳代謝率不同，因而 它的劑量必須仔細(xì)監(jiān)測(cè)，否則就會(huì)因超劑量而造成出血或因?yàn)閯┝坎蛔銓?dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，血 栓形成。由此可見(jiàn)在凝血酶原時(shí)間的測(cè)定中，準(zhǔn)確的INR結(jié)果對(duì)臨床抗凝治療藥物的監(jiān)測(cè) 非常重要。但是不同ISI值的PT試劑測(cè)得的INR結(jié)果差異非常顯著，而且當(dāng)標(biāo)本的INR值 越高時(shí)，測(cè)定結(jié)果差異越顯著。理論上，ISI值越接近1. 0,表明試劑越敏感。
[0005] 但是由于實(shí)驗(yàn)室使用PT試劑質(zhì)量上的不同，使得同一個(gè)患者在不同醫(yī)院測(cè)定的 結(jié)果相差懸殊，造成檢測(cè)結(jié)果的不一致，影響對(duì)疾病的正確、及時(shí)診斷。因此，PT試劑的質(zhì) 量成了獲得準(zhǔn)確結(jié)果及診斷的關(guān)鍵。同時(shí)，由于試劑復(fù)溶后的穩(wěn)定性差，造成浪費(fèi)，導(dǎo)致醫(yī) 療單位成本增加，患者負(fù)擔(dān)加重。所W研制一種安全、可靠、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng)的PT試 劑，對(duì)臨床診斷疾病來(lái)說(shuō)是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服上述現(xiàn)有【背景技術(shù)】中的不足，本發(fā)明提供一種凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒 及其制備方法，該凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒通過(guò)含有多種有效成分的緩沖液體系與兔腦粉 和組織因子醋化物的結(jié)合，解決了單一成分試劑的敏感度不受控的問(wèn)題，進(jìn)一步得到準(zhǔn)確 性、重復(fù)性及穩(wěn)定性等總體性能更好的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒，包括凝血酶原時(shí) 間測(cè)定試劑，所述凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑由凝血活酶和緩沖液體系組成，所述凝血活酶包 括兔腦粉和組織因子醋化物，兔腦粉在緩沖體系中的用量占緩沖液重量的2~8wt%，組織 因子醋化物在緩沖液體系中的用量占緩沖液重量的0. 1~0. 5wt%;所述緩沖液體系中各 組分含量為：〇. 1~0. 48wt%的TAPS0、0. 5~1. 8wt%的甘氨酸、0. 4~1.Owt%的聚乙二醇 6000、0. 4~1.Owt%的硫酸鋼、0. 01~0. 2wt%的疊氮化鋼、0. 01~0. 2wt%的化ij-35、 6~20mM的氯化巧，其余為水，所述緩沖液體系的抑值為5. 0~7. 0。
[0008] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述兔腦粉在緩沖體系中的用量占緩沖液重量的 4 ~6wt%。
[0009] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述組織因子醋化物在緩沖液體系中的用量占緩沖 液重量的0. 32~0. 43wt%。
[0010] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述TAPS0在緩沖液體系中的含量為0. 3 5~ 0. 43wt%。
[0011] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述甘氨酸在緩沖液體系中的含量為1.0~ 1. 2wt%。
[0012] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述聚乙二醇6000在緩沖液體系中的含量為0. 6~ 0. 8wt%。
[0013] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述硫酸鋼在緩沖液體系中的含量為0.5~ 0. 7wt%。
[0014] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述疊氮化鋼在緩沖液體系中的含量為0. 05~ 0. 15wt% 〇
[001引優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述Brij-35在緩沖液體系中的含量為0. 07~ 0.Iwt% 0
[0016] 優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，所述氯化巧在緩沖液體系中的含量為7. 2~12mM。
[0017] 本發(fā)明還提供一種制備上述凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒的方法，其特征在于，包括 如下步驟：包括如下步驟：（1)按照不同配比配制緩沖液體系，溫浴，稱量兔腦粉加入溫浴 中的緩沖液體系，攬拌混勻，將混勻后的混合溶液離屯、，取上層液體后加入組織因子醋化 物，充分混勻后得到初始的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑；（2)將初始試劑在血凝儀上進(jìn)行質(zhì)控 的測(cè)定，將質(zhì)控測(cè)定結(jié)果調(diào)至符合該機(jī)型血凝儀配套質(zhì)控說(shuō)明書要求的范圍，測(cè)定結(jié)果最 接近質(zhì)控平均值的試劑配方確定為相應(yīng)機(jī)型最終的試劑配比；（3)W最終的試劑配比，按 照步驟（1)的配制方法得到最終的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑，經(jīng)過(guò)分裝、凍干，即配制成為凝 血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：提供一種凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒及其制備方法，該凝血酶 原時(shí)間測(cè)定試劑盒通過(guò)含有多種有效成分的緩沖液體系與兔腦粉和組織因子醋化物的結(jié) 合，解決了單一成分試劑的敏感度不受控的問(wèn)題，進(jìn)一步得到準(zhǔn)確性高、重復(fù)性強(qiáng)及穩(wěn)定性 好且適用于多種半自動(dòng)/全自動(dòng)血凝儀的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑。
【具體實(shí)施方式】
[0019]W下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0020] 本發(fā)明的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒，包括凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑，所述凝血酶原 時(shí)間測(cè)定試劑由緩沖液體系和溶解在緩沖液體系中的凝血活酶組成，凝血活酶包括兔腦粉 和組織因子醋化物，兔腦粉在緩沖體系中的用量占緩沖液重量的2~8wt%，組織因子醋化 物在緩沖液體系中的用量占緩沖液重量的0. 1~0. 5wt% ;緩沖液體系中各組分含量為： 0. 1 ~0. 48wt% 的TAPS0、0. 5 ~1. 8wt% 的甘氨酸、0. 4 ~1.Owt% 的聚乙二醇 6000、0. 4 ~ 1. Owt%的硫酸鋼、0. 01~0. 2wt%的疊氮化鋼、0. 01~0. 2wt%的化ij-35、6~20mM的氯 化巧，其余為水，緩沖液體系的抑值為5. 0~7. 0。使用本發(fā)明試劑盒時(shí)，待測(cè)血漿與凝血 酶原時(shí)間測(cè)定試劑用量的體積比為1:1. 9~2. 2。
[0021] 制備上述凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒的方法，包括如下步驟：（1)按照不同配比配 制緩沖液體系，溫浴，稱量兔腦粉加入溫浴中的緩沖液體系，攬拌混勻，將混勻后的混合溶 液離屯、，取上層液體后加入組織因子醋化物，充分混勻后得到初始的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試 劑；（2)將初始試劑在血凝儀上進(jìn)行質(zhì)控的測(cè)定，將質(zhì)控測(cè)定結(jié)果調(diào)至符合該機(jī)型血凝儀 配套質(zhì)控說(shuō)明書要求的范圍，測(cè)定結(jié)果最接近質(zhì)控平均值的試劑配方確定為相應(yīng)機(jī)型最終 的試劑配比；做^最終的試劑配比，按照步驟（1)的配制方法得到最終的凝血酶原時(shí)間ii 定試劑，經(jīng)過(guò)分裝、凍干，即配制成為凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒，包括凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑，凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑 由緩沖液體系和溶解在所述緩沖液體系中的凝血活酶組成，凝血活酶包括兔腦粉和組織因 子醋化物，兔腦粉在緩沖體系中的用量占緩沖液重量的7wt%，組織因子醋化物在緩沖液 體系中的用量占緩沖液重量的0. 25wt% ;緩沖液體系中各組分含量為：0. 32wt%的TAPS0、 1. 36wt%的甘氨酸、0. 92wt%的聚乙二醇6000、，0. 47wt%的硫酸鋼、0. 03wt%的疊氮化鋼、 0. 16wt%的化ij-35、14mM的氯化巧，其余為水，緩沖液體系的抑值為5. 0。
[0024]制備凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒的方法，包括如下步驟：（1)按照不同配比配制緩 沖液體系，溫浴，稱量兔腦粉加入