修飾的TGF-β寡核苷酸的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】修飾的TGF-β寡核苷酸
[0001] 本發(fā)明涉及由TGF-β 2核酸序列的選定區(qū)域或TGF-β 1或TGF-β 3核酸序列的 選定區(qū)域的10-20個(gè)核苷酸組成的寡核苷酸，其包含修飾的核苷酸，如LNA、ENA、聚環(huán)氧烷、 2' -氟、2' -0-甲氧基和/或2' -0-甲基修飾的核苷酸。 技術(shù)背景
[0002] 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子MTGF-β)是一種在大多數(shù)細(xì)胞中控制增殖、細(xì)胞分化和其他功 能的蛋白質(zhì)。它是一種類(lèi)型的細(xì)胞因子，其在免疫、癌癥、心臟病、糖尿病、馬凡綜合征、洛伊 斯-迪茨綜合征、帕金森病和AIDS等中起作用。
[0003] TGF-β是一種分泌的蛋白，其以至少三種同種型的形式存在（TGF-β 1、TGF-β 2 和TGF-β 3)，由不同基因編碼，但共有強(qiáng)序列和結(jié)構(gòu)同源性。TGF-β在正常上皮細(xì)胞和 癌發(fā)生的早期以抗增殖因子的形式起作用。然而，在腫瘤發(fā)展的晚期，TGF-β通過(guò)包括 誘導(dǎo)上皮至間質(zhì)瘤轉(zhuǎn)變（EMT)的機(jī)制促進(jìn)腫瘤，該轉(zhuǎn)變是一種被認(rèn)為參與腫瘤進(jìn)展、侵染 和轉(zhuǎn)移的過(guò)程（參見(jiàn)"Glycoproteomic analysis of two mouse mammary cell lines during transforming growth factor (TGF)-beta induced epithelial to mesenchymal transiti〇n(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF)-P誘導(dǎo)的上皮至間質(zhì)瘤轉(zhuǎn)變期間兩種小鼠乳腺細(xì)胞系 的糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析）" 7th space, com. 2009-01-08.恢復(fù)：2009-01-29)。
[0004] 在正常（上皮）細(xì)胞中，TGF- β在GI期停止細(xì)胞周期（并停止細(xì)胞增殖）、誘導(dǎo) 分化或促進(jìn)凋亡。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞時(shí)，TGF-β不再抑制細(xì)胞增殖，其通常是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑中突變的結(jié)果，且癌細(xì)胞增殖。間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖也由TGF-β誘導(dǎo)。兩種細(xì)胞都 提高其TGF-β生產(chǎn)。該TGF-β作用于周?chē)g質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞和腫瘤 微環(huán)境（參見(jiàn) Pickupet 等，"The roles of TGF6 in the tumour microenvironment (腫 瘤微環(huán)境中 TGF6 的作用）"，Nature Reviews Cancer (2013)，13:788-799)。因而，其促進(jìn) 血管生成，并通過(guò)抑制增殖和免疫細(xì)胞的激活導(dǎo)致免疫抑制。
[0005] TGF- β 1缺陷型小鼠死于心、肺和胃炎癥，暗示TGF- β在抑制炎性細(xì)胞激活和增 殖方面至關(guān)重要。Smad3是TGF-β依賴(lài)性下游信號(hào)通路中的關(guān)鍵元件之一。Smad3缺陷 型小鼠由于T細(xì)胞激活和粘膜免疫受損而發(fā)生慢性粘膜感染，暗示TGF-β在這些過(guò)程中 的關(guān)鍵作用。對(duì)于癌癥，某些癌細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的TGF-β抑制浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的活性， 從而幫助腫瘤逃脫宿主免疫監(jiān)控。該免疫抑制作用可以是另一種重要機(jī)制，TGF-β通過(guò) 該機(jī)制刺激晚期腫瘤的生長(zhǎng)（參加 Blobe GC等，2000年5月，"Role of transforming growth factor beta in human disease(人疾病中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β 的作用）"，N.Engl. J. Med. 342 (18)，1350-1358)。TGF-β還將正常情況下使用炎性（免疫）反應(yīng)攻擊癌癥的效 應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為關(guān)閉炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)性（抑制）T細(xì)胞。
[0006] 此外，TGF-β是胞外基質(zhì)產(chǎn)生和沉積的最有力調(diào)控因子之一。其通過(guò)兩種主要 機(jī)制刺激胞外基質(zhì)的產(chǎn)生并影響其粘附性質(zhì)。首先，TGF-β刺激成纖維細(xì)胞和其他細(xì)胞 產(chǎn)生胞外基質(zhì)蛋白和細(xì)胞粘附蛋白，包括膠原、纖連蛋白和整聯(lián)蛋白。其次，TGF-β減少 降解胞外基質(zhì)的酶（包括膠原酶、肝素酶和間質(zhì)溶解素）的產(chǎn)生，并增加抑制降解胞外基 質(zhì)的酶的蛋白質(zhì)（1型纖溶酶原激活物抑制劑和金屬蛋白酶的組織抑制劑）的產(chǎn)生。這些 變化的凈作用是增加胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生并以細(xì)胞特異性方式提高或降低細(xì)胞的粘附性 質(zhì)。TGF-β產(chǎn)生在許多癌細(xì)胞中增加，其通過(guò)提高細(xì)胞的蛋白水解活性和促進(jìn)其結(jié)合細(xì)胞 粘連分子來(lái)提高細(xì)胞的侵染性（參見(jiàn)Blobe GC等，2000年5月，〃Role of transforming growth factor beta in human disease(人疾病中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β 的作用）〃，N.Engl. J. Med. 342(18)，1350-1358)。
[0007] 因此，能夠分別影響TGF-β表達(dá)和活性的治療劑至關(guān)重要，特別是用于預(yù)防和/ 或治療TGF-β相關(guān)疾病時(shí)。例如，EP 1008649和EP 0695354公開(kāi)了與TGF-βΙ和/或 TGF-β 2的mRNA雜交的寡核苷酸，且其適用于制造例如用于預(yù)防和/或治療癌癥的藥物組 合物。這些寡核苷酸無(wú)一包含諸如LNA、ENA等的修飾。
[0008] 例如，WO 2003/85110、WO 2005/061710 和 WO 2008/138904 涉及可用于治療癌癥 的包含核苷酸修飾的寡核苷酸，其分別涉及抑制HIF-1A、Bcl-2和HER3。
[0009] 寡核苷酸選擇的標(biāo)準(zhǔn)主要是寡核苷酸的長(zhǎng)度、GC百分比、形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的趨勢(shì)、二 聚化和解鏈溫度（Tm)。通常，優(yōu)選高Tm(解鏈溫度）。此外，這些寡核苷酸必須特異性針對(duì) 靶mRNA且不與非靶mRNA雜交以降低潛在的脫靶作用。
[0010] 因此，科學(xué)和醫(yī)療上非常需要降低或抑制TGF-β表達(dá)和/或活性的治療劑。具體 而言，持續(xù)需要諸如反義寡核苷酸的寡核苷酸，其與TGF- β UTGF- β 2和/或TGF- β 3特異 性相互作用并因此降低或抑制其表達(dá)，或者特異性抑制TGF-β 1和TGF-β 2、或TGF-β 1和 TGF- β 3、或TGF- β 2和TGF- β 3的表達(dá)，而不導(dǎo)致任何（嚴(yán)重的）副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明涉及的寡核苷酸由SEQ ID Ν0.1的TGF-02核酸序列（參見(jiàn)圖2)或 SEQ ID NO. 335 的 TGF- β 1 核酸序列（參見(jiàn)圖 12)或 SEQ ID NO. 336 的 TGF- β 3 核酸 序列（參見(jiàn)圖25)的10-20個(gè)（優(yōu)選12-18個(gè)）核苷酸組成，該寡核苷酸中的一個(gè)或 多個(gè)核苷酸是經(jīng)修飾的。本發(fā)明的一些寡核苷酸對(duì)應(yīng)于TGF-β 1、TGF-β 2和TGF-β 3， 或 TGF-β 1 和 TGF-β 2 或 TGF-β 1 和 TGF-β 3 或 TGF-β 2 和 TGF-β 3。優(yōu)選的寡核苷 酸包含 SEQ ID NO. 2-149 (TGF-β 2)之一、SEQ ID No. 150-334 (TGF-β?)之一或 SEQ ID No. 337-402 (TGF- β 3)之一或由其組成，其示于表1。
[0012] 具體而言，本發(fā)明的寡核苷酸包含SEQ ID NO. 1的第1380-1510位核酸區(qū)域的 10-20個(gè)（優(yōu)選12-18個(gè)）核苷酸或由其組成，該寡核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸是經(jīng)修 飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑制TGF-β 2表達(dá)和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核 苷酸包含或由以下序列組成：SEQ ID NO. 2 (如 ASPH36: GACCAGATGCAGGA)、SEQ ID NO. 3 (如 ASPH80:GCGACCGTGACCAGAT)、SEQIDN0·4(如ASPH98:GCGCGACCGTGACC)、SEQIDN0·5(如 ASPH111:AGCGCGACCGTGA)，或 SEQ ID Ν0·6(如 ASPH121 或 ASPH153:GACCGTGACCAGAT)、 SEQ ID NO·7(如 ASPH15:CTGCCCGCGGAT)、SEQ ID NO·8(如 ASPH17:TCTGCCCGCGGAT)、 SEQ ID Ν0·9(如 ASPH26 或 ASPH27:GGATCTGCCCGCGGA)、SEQ ID NO. 10(如 ASPH37:CTTGCTCAGGATCTGCC)、SEQ ID NO. 11(如 ASPH52 或 53:GCTCAGGATCTGCCCGCGGA)、 SEQIDN0·12(如ASPH112:GGATCGCCTCGAT)、SEQIDN0·13(如ASPH119:CCGCGGATCGCC)， 或 SEQ ID NO. 31(如 ASPH30:CGATCCTCTTGCGCAT)。
[0013] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 1的TGF-β 2 核酸序列的第2740-2810位核酸區(qū)域的10-20個(gè)（優(yōu)選12-18個(gè)）核苷酸或由其組成，該 寡核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸是經(jīng)修飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑制TGF-β 2 表達(dá)和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核苷酸包含或由以下序列組成：SEQ ID NO. 57(如 ASPH65:TCTGAACTAGTACCGCC)、SEQ ID Ν0·73(如 ASPH82:AACTAGTACCGCCTTT)，或 SEQ ID NO. 103(如 ASPHl15:CTAGTACCGCCTT)。
[0014] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 1的 TGF-β 2核酸序列的第1660-1680位核酸區(qū)域的10-20個(gè)（優(yōu)選12-18個(gè)）核苷酸或 由其組成，該寡核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸是經(jīng)修飾的。這些寡核苷酸分別在降低 和抑制TGF-β 1和/或TGF-β 2表達(dá)和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核苷酸包含或 由以下序列組成：SEQ ID NO. 14(如 ASHPOl 或 ASPH02:ACCTCCTTGGCGTAGTA)、SEQ ID NO. 15(如 ASPH03 或 ASPH04:CCTCCTTGGCGTAGTA)、SEQ ID NO. 16(如 ASPH05、ASPH06 或 ASPH07:CTCCTTGGCGTAGTA)，或 SEQ ID NO. 17(如 ASPH08:TCCTTGGCGTAGTA)。
[0015] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 1的TGF-β 2 核酸序列的第2390-2410位核酸區(qū)域的10-20個(gè)（優(yōu)選12-18個(gè)，最優(yōu)選13個(gè)）核苷酸或 由其組成，該寡核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸是經(jīng)修飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑 制TGF-β UTGF-β 2和/或TGF-β 3表達(dá)和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核苷酸包含或由 以下序列組成：SEQ ID NO. 18 (如 ASPH9 或 ASPH10:CAGAAGTTGGCAT)。
[0016] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 1的TGF-β 2 核酸序列的10-20個(gè)（優(yōu)選12-18個(gè)）核苷酸或由其組成，該寡核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)核 苷酸是經(jīng)修飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑制TGF- β 1、TGF- β 2和/或TGF- β 3 (且 最優(yōu)選TGF-β 2)表達(dá)和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核苷酸包含或由以下序列之一組成： SEQ ID NO. 19-56、58-72、74-102、104-138(例如 ASHPl 1-ASPH14、ASPH16、ASPH18-ASPH25、 ASPH28-ASPH35、ASPH38-ASPH51、ASPH60-64、ASPH66-ASPH79、ASPH81、ASPH83-ASPH97、 ASPH99-ASPH110、ASPH113、ASPH114、ASPH116-118、ASPH120、ASPH122-ASPH152、 ASPH154-ASPH183,或 T-LNA(SEQ ID N0:144))。
[0017] 本發(fā)明中優(yōu)選的寡核苷酸分別是ASPHO1、ASPH03、ASPH05、ASPHl7、ASPH22、 ASPH26、ASPH27、ASPH35、ASPH36、ASPH37、ASPH45、ASPH47、ASPH48、ASPH65、ASPH69、ASPH71、 ASPH80、ASPH82、ASPH98、ASPH105、ASPH115、ASPH190、ASPH191、ASPH192 和 ASPH193。
[0018] 本發(fā)明中其他優(yōu)選的寡核苷酸是表1所示的ASPH1000至ASPH1132,其優(yōu)選抑制 TGFf3 I mRNA的表達(dá)和/或活性。該組中優(yōu)選的寡核苷酸分別是例如ASPH1047、ASPH1051、 ASPH1059、ASPHl 106、ASPHl 139、ASPHl 150、ASPHl 162、ASPHl 163、ASPHl 175、ASPHl 178 和 ASPHl181〇
[0019] 在替代性實(shí)施方式中，寡核苷酸優(yōu)選抑制TGF0 3 mRNA的表達(dá)和/或活性。這 類(lèi)寡核苷酸分別是例如 ASPH2000、ASPH2001、ASPH2002、ASPH2003、ASPH2004、ASPH2005、 ASPH2006、ASPH2007、ASPH2008、ASPH2009、ASPH2010、ASPH2011、ASPH2012、ASPH2013、 ASPH2014、ASPH2015、ASPH2016、ASPH2017、ASPH2018、ASPH2019、ASPH2020、ASPH2021、 ASPH2022、ASPH2023、ASPH2024、ASPH2025、ASPH2026、ASPH2027、ASPH2028、ASPH2029、 ASPH2030、ASPH2031、ASPH2032、ASPH2033、ASPH2034、ASPH2035、ASPH2036、ASPH2037、 ASPH2038、ASPH2039、ASPH2040、ASPH2041、ASPH2042、ASPH2043、ASPH2044、ASPH2045、 ASPH2046、ASPH2047、ASPH2048、ASPH2049、ASPH2050、ASPH2051、ASPH2052、ASPH2053、 ASPH2054、ASPH2055、ASPH2056、ASPH2057、ASPH2058、ASPH2059、ASPH2060、ASPH2061、 ASPH2062、ASPH2063、ASPH2064、ASPH2065 和 ASPH2066。
[0020] 本發(fā)明的寡核苷酸顯示對(duì)TGF- β 1、TGF- β 2或TGF- β 3,或TGF- β 1和TGF- β 2 的意料之外的強(qiáng)且特異性抑制?；蛘撸景l(fā)明的寡核苷酸顯示對(duì)TGF-β 1和TGF-β 3或 TGF- β 1和TGF- β 2或TGF- β 2和TGF- β 3,并在另一情況下顯示對(duì)TGF- β I、TGF- β 2和 TGF-β 3的強(qiáng)且特異性抑制。
[0021] 本發(fā)明的核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的修飾選自LNA、ΕΝΑ、聚環(huán)氧烷（如三甘 醇（TEG))、2'_氟、2'-0-甲氧基和2'-0-甲基。這些修飾優(yōu)選位于寡核苷酸的5'和/或 3'端。包含這類(lèi)修飾的核苷酸的寡核苷酸是修飾的寡核苷酸。
[0022] 修飾的核苷酸是排列為例如一列（彼此直接緊鄰）或不同的模式（此時(shí)一個(gè)或多 個(gè)未修飾的核苷酸在一個(gè)修飾的核苷酸后）。例如，寡核苷酸以一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸起 始，隨后是一個(gè)或多個(gè)（如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)）未修飾的或未鎖定的（unlocked)核苷 酸，隨后再是一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，該寡核苷酸的兩端都包含相同 模式的修飾的和未修飾的或未鎖定的核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，3'和5'端的修飾模式 不同，包括一端不包含修飾的核苷酸。優(yōu)選地，修飾的寡核苷酸包含連續(xù)8或9個(gè)未鎖定的 核苷酸。
[0023] 或者，該寡核苷酸中任何其他位置的核苷酸，或者該寡核苷酸的5'和/或3' 端處和該寡核苷酸中的任何其他位置的至少一個(gè)核苷酸是經(jīng)修飾的。例如，ASPH1071、 ASPHl100、ASPHl109、ASPH 1110、ASPH1111、ASPH1115、ASPHl126、ASPHl127 和 ASPHl128 屬 于一組TGF-β寡核苷酸，例如TGF-β 1寡核苷酸，其包含處于不同模式（例如由未鎖定的 核苷酸隔開(kāi)彼此）中的修飾的核苷酸（如LNA、ENA等）。這些寡核苷酸包含一種類(lèi)型的修 飾，或一種或多種不同的修飾。任選地，寡核苷酸的兩個(gè)連續(xù)核苷酸（修飾或未修飾的）之 間的至少一個(gè)磷酸連接是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的寡核 苷酸是硫代磷酸酯。
[0024] 此外，本發(fā)明涉及TGF-β反義寡核苷酸，其與超過(guò)一種TGF-β同種型相互作用并 抑制其表達(dá)，即使在寡核苷酸與TGF- β I、TGF- β 2和/或TGF- β 3序列非100 %互補(bǔ)的情況 下也是如此。這類(lèi)反義寡核苷酸分別是例如ASPH1024、ASPH1096、ASPH1131和ASPH1132。這 些寡核苷酸優(yōu)選與不同物種（如人和小鼠）的TGF-β序列相互作用，例如分別是ASPH1131 和 ASPHl132。
[0025] 不同實(shí)施方式的所有寡核苷酸均用于預(yù)防和/或治療以下疾病的方法：惡性或良 性腫瘤、免疫疾病、纖維化（如特發(fā)性肺纖維化、腎臟纖維化、腎纖維化）、硬化（肝硬化）、 硬皮病或相關(guān)皮膚疾病、眼疾?。ㄈ缜喙庋刍蚝竽夷せ鞚幔≒CO) )、CNS疾病、脫發(fā)等。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1顯示核苷酸修飾的示例。
[0027] 圖 2 顯示人 TGF- β 2 mRNA 的核酸序列（ΝΜ_003238· 3)。
[0028] 圖3a)至3c)顯示人Α172神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TGF- β 1和TGF- β 2 mRNA表達(dá)的抑 制。以IOnM的劑量使用不同的修飾的寡核苷酸轉(zhuǎn)染A172細(xì)胞（在轉(zhuǎn)染試劑存在的情況 下），并在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)測(cè)量TGF- β 1 (白色柱）和TGF- β 2 (黑色柱）mRNA表達(dá)的抑制。 圖3&)是以下修飾的寡核苷酸的結(jié)果45?!101、45?!102、45?!103、45?!104、45?!105、45?!106、 ASPH07、ASPH08、ASPH09、ASPH10、ASPH11、ASPH12、ASPH13、ASPH14、ASPH15、ASPH16、ASPH17、 ASPH18、ASPH19、ASPH20、ASPH21、ASPH22、ASPH24、ASPH25、ASPH26、ASPH27、ASPH29、ASPH30、 ASPH31、ASPH32、ASPH33、ASPH34、ASPH35、ASPH36、ASPH37、ASPH38、ASPH39、ASPH40、ASPH41、 ASPH