一種提取dna的方法和解離染色質(zhì)的方法以及高氯酸鹽的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種解離染色質(zhì)的方法、一種提取DNA的 方法和高氯酸鹽的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 染色質(zhì)是遺傳物質(zhì)的載體。染色質(zhì)是指間期細胞核內(nèi)由DNA、組蛋白、非組蛋白及 少量RNA組成的線性復(fù)合結(jié)構(gòu)，是間期細胞遺傳物質(zhì)存在的形式。核小體是組成染色質(zhì)的 基本組成單位，由基因組DNA和5種組蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4共同組成。2分子的H2A、 H2B、H3和H4共同構(gòu)成八聚體的核心組蛋白，DNA雙螺旋纏繞在這一核心上形成核小體的核 心顆粒。核心顆粒間由DNA和組蛋白Hl構(gòu)成的連接區(qū)而連接成串珠樣結(jié)構(gòu)。在哺乳動物基 因組DNA的提取環(huán)節(jié)中，無論是經(jīng)典提取方法（酚抽提法、異丙醇沉淀法和甲酰胺裂解法） 還是后期改良的方法，通常都是利用表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS)來裂解細胞，利 用蛋白酶K來降解核小體中的組蛋白，從而實現(xiàn)基因組DNA的分離。然而，由于利用蛋白酶 K對組蛋白進行酶解消化，經(jīng)典方法不僅需要加熱設(shè)備（如水浴鍋），而且增加了操作步驟， 環(huán)節(jié)繁瑣，實驗用時長。
[0003] 鹽酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉和高氯酸鈉作為離液劑可以用于DNA的提取。如 CN1187196A公開了一種用于提取DNA的方法和裝置，涉及了鹽酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉和高 氯酸鈉的使用，但是，上述離液劑在用于提取基因組DNA時，存在得率低的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有用于DNA的提取方法的得率低的缺陷，提供一種具有得 率高等優(yōu)勢的DNA提取方法。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種解離染色質(zhì)的方法，該方法包括： 將含有染色質(zhì)的樣品與解離劑混合；其中，所述解離劑含有高氯酸鋰。
[0006] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種提取DNA的方法，所述DNA在提取前存在于染色質(zhì) 中；其中，該方法包括如下步驟：（1)將含有染色質(zhì)的樣品與解離劑混合均勻，得到解離后 的物料；（2)將所述解離后的物料與蛋白抽提液混合均勻，分離得到蛋白抽提后的上清液； (3)將所述蛋白抽提后的上清液與DNA沉淀劑混合，得到DNA沉淀；其中，所述解離劑含有 高氯酸鋰。
[0007] 再一方面，本發(fā)明還提供了一種高氯酸鹽在提取DNA中的用途，所述DNA在提取前 存在于染色質(zhì)中，其中，所述高氯酸鹽為高氯酸鋰。
[0008] 通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明以化學(xué)物質(zhì)高氯酸鋰（LiClO4)替代蛋白酶K來解離組 蛋白和基因組DNA，這種方法具有操作簡單、重復(fù)性好，穩(wěn)定性高的優(yōu)點，同時避免了蛋白酶 K法需要較高溫度（如50-65°C )加熱及長時間消化的劣勢。與傳統(tǒng)蛋白酶K消化法相比， 本發(fā)明能高效、快速、簡便地提取人類基因組DNA，且基因組完整性更好，可用于PCR、芯片 分析、分子克隆等分子生物學(xué)相關(guān)實驗。并且，與使用高氯酸鈉進行DNA提取的技術(shù)方案相 比，本發(fā)明具有得率高的優(yōu)勢。
[0009] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【附圖說明】
[0010] 附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0011] 圖1是高氯酸鋰法（LiCKV法）和蛋白酶K法兩種基因組DNA提取方法提取臍帶 組織和臍帶間充質(zhì)干細胞基因組DNA的電泳檢測結(jié)果。
[0012] 圖2是高氯酸鋰法（LiCKV法）中利用不同的LiClO4終濃度所提取的臍帶間充質(zhì) 干細胞基因組DNA的電泳檢測結(jié)果。
[0013] 圖3是高氯酸鋰法（LiCKV法）和高氯酸鈉法（NaClO 4法）兩種基因組提取方法 的電泳檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0014] 以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描 述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0015] -方面，本發(fā)明提供了一種解離染色質(zhì)的方法，該方法包括：將含有染色質(zhì)的樣品 與解離劑混合；其中，所述解離劑含有高氯酸鋰。
[0016] 其中，將含有染色質(zhì)的樣品與解離劑混合后，高氯酸鋰的終濃度可以在較大范圍 內(nèi)變化，例如可以為〇· 1-3. 9mol/L，優(yōu)選為0· 25-3. 5mol/L，更優(yōu)選為2-3mol/L〇
[0017] 其中，優(yōu)選地，所述解離劑含有高氯酸鋰的水溶液。
[0018] 其中，優(yōu)選地，所述高氯酸鋰的水溶液中，高氯酸鋰的濃度只要高于高氯酸鋰的終 濃度即可，例如可以為不低于2mol/L且不高于飽和濃度，優(yōu)選為不低于4mol/L且不高于飽 和濃度。
[0019] 其中，作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述含有染色質(zhì)的樣品中含有裂解液；所 述裂解液含有表面活性劑。
[0020] 其中，所述表面活性劑包括但不限于吐溫-20、Triton X-100和NP40中的至少一 種。所述裂解液中，所述表面活性劑的濃度可以為〇. 1-10%體積比，優(yōu)選為〇. 5-5%體積 比。
[0021] 其中，所述裂解液中還含有平衡鹽、離子螯合劑和RNase A。所述平衡鹽包括但不 限于Tris-HCl和HEPES中的至少一種。所述離子螯合劑包括但不限于EDTA和檸檬酸鈉中 的至少一種。所述裂解液中，所述平衡鹽的濃度為10-100mm 〇l/L，優(yōu)選為30-70mmol/L ;所 述離子螯合劑的濃度為5-40mmol/L，優(yōu)選為10-30mmol/L ;RNase A的濃度為5-40 μ g/mL， 優(yōu)選為10-30 μ g/mL。所述裂解液的pH值可以為7. 5-8. 5。
[0022] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種提取DNA的方法，所述DNA在提取前存在于染色質(zhì) 中；其中，該方法包括如下步驟：（1)將含有染色質(zhì)的樣品與解離劑混合均勻，得到解離后 的物料；（2)將所述解離后的物料與蛋白抽提液混合均勻，分離得到蛋白抽提后的上清液； (3)將所述蛋白抽提后的上清液與DNA沉淀劑混合，得到DNA沉淀；其中，所述解離劑含有 高氯酸鋰。
[0023] 其中，將含有染色質(zhì)的樣品與解離劑混合后，高氯酸鋰的終濃度可以在較大范圍 內(nèi)變化，例如可以為〇· 1-3. 9mol/L，優(yōu)選為0· 25-3. 5mol/L，更優(yōu)選為2-3mol/L〇
[0024] 其中，優(yōu)選地，所述解離劑含有高氯酸鋰的水溶液。
[0025] 其中，優(yōu)選地，所述高氯酸鋰的水溶液中，高氯酸鋰的濃度只要高于高氯酸鋰的終 濃度即可，例如可以為不低于2mol/L且不高于飽和濃度，優(yōu)選為不低于4mol/L且不高于飽 和濃度。
[0026] 其中，作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，該方法還包括：將含有染色質(zhì)的生物材料 與裂解液混合進行裂解，并且將裂解得到的裂解產(chǎn)物作為含有染色質(zhì)的樣本進行步驟（1) 的操作；所述裂解液含有表面活性劑
[0027] 其中，所述表面活性劑包括但不限于吐溫-20、Triton X-100和NP40中的至少一 種。所述裂解液中，所述表面活性劑的濃度可以為〇. 1-10%體積比，優(yōu)選為〇. 5-5%體積 比。其中，所述裂解液中還含有平衡鹽、離子螯合劑和RNase A。所述平衡鹽包括但不限于 Tris-HCl和HEPES中的至少一種。所述離子螯合劑包括但不限于EDTA和檸檬酸鈉中的至 少一種。所述裂解液中，所述平衡鹽的濃度為10-100mm 〇l/L，優(yōu)選為30-70mmol/L ;所述離 子螯合劑的濃度為5-40mmol/L，優(yōu)選為10-30mmol/L ;RNase A的濃度為5-40 μ g/mL，優(yōu)選 為10-30 μ g/mL。所述裂解液的pH值可以為7. 5-8. 5。
[0028] 其中，該方法還可以進一步包括：將原始生物材料進行預(yù)處理，以獲得適合直接用 于裂解的含有染色質(zhì)的生物材料。所述預(yù)處理的操作包括清洗、干燥、剪碎、研磨、冷凍和凍 融中的至少一種?？梢园凑毡绢I(lǐng)域常規(guī)的方式進行預(yù)處理的操作，例如按照《分子克隆實驗 指南》中記載的內(nèi)容進行操作。
[0029] 其中，所述原始生物材料可以包括組織、器官、個體和共生體中的至少一種。所述 含有染色質(zhì)的生物材料可以包括血液、血細胞和人工培養(yǎng)細胞中的至少一種。
[0030] 其中，該方法還包括：將所述DNA沉淀進行洗滌和再溶解。其中，進行洗滌所用的 洗滌液可以為60-80體積％濃度的乙醇水溶液，進行再溶解所用的溶劑可以為水或TE緩沖 液。
[0031 ] 再一方面，本發(fā)明還提供了一種高氯酸鹽在提取DNA中的用途，所述DNA在提取前 存在于染色質(zhì)中，其中，所述高氯酸鹽為高氯酸鋰。
[0032] 以下通過實施例進一步詳細說明本發(fā)明。
[0033] 實施例1 :
[0034] 本實施例用于說明從細胞樣品中提取DNA的操作。
[0035] (1)樣品預(yù)處理：以臍帶間充質(zhì)干細胞為例，將培養(yǎng)瓶中的臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng) PBS洗滌一次后，用胰酶消化，收集細胞懸液后，計數(shù)，取約為2. 5 X IO5個細胞的懸液，1000 g 離心5min，棄上清，用ImL預(yù)冷的PBS重懸細胞并轉(zhuǎn)入I. 5mL EP管中，1000 g離心5min，棄 上清，用50 μ L TE緩沖液重懸細胞；
[0036] (2)分別采用高氯酸鋰法以及經(jīng)典的蛋白酶K法兩種方法提取：向步驟⑴的EP 管中加入500 μ L裂解液，充分混勻。其中高氯酸鋰法裂解液配方為：Tris-HCl (pH 8. 0) (50mmol/L)、EDTA(20mmol/L)、Tween-20(l% (v/v))、RNase A(20yg/mL);蛋白酶 K 法的裂 解配方為：Tris-HCl (pH 8· 0) (lOmmol/L)、EDTA(pH8. 0) (lOOmmol/L)、SDS(0. 5% (m/V));
[0037] (3)向步驟⑵的EP管中分別加入終濃度為3mol/L的蛋白變性劑LiClO4以及 100 μ g/mL蛋白酶K，振蕩混勻，其中加入蛋白酶K法需要在55°C放置2h，其余步驟相同；
[0038] (4)向步驟（3)的EP管中加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1)，振蕩混勻， 離心至溶液分層，將上層液體轉(zhuǎn)移至另一潔凈的EP管中?？芍貜?fù)本步驟一次，并用氯仿抽 提一次上清，將上清轉(zhuǎn)移至另一潔凈的EP管中；
[0039] (5)向步驟⑷的EP管中加入等體積的異丙醇，-20°C放置20min，離心收集基因 組 DNA ;
[0040] (6)向步驟（5)的EP管中加入ImL的70 %乙醇洗滌DNA，去上清，敞口晾干基因 組；
[0041] (7)向步驟（6)的EP管中加入100 μ L TE緩沖液，溶解基因組DNA沉淀。利用光 密度測定法測定基因組DNA的濃度，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。
[0042]