新化合物及其制備方法和在制備抗菌抗腫瘤藥物中的應(yīng)用
【專利說明】
[0001] 本分案申請是專利申請?zhí)枮椋?01310180810. 5,發(fā)明名稱為：鏈霉菌、新化合物及 其制備方法和在制備抗菌抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，申請日為：2013年05月15日的專利申請 的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域：
[0002] 本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，具體涉及一株能夠產(chǎn)生多個napyradiomycins類 新抗生素化合物的海洋來源鏈霉菌Streptomyces sp.SCSIO 10428,以及利用該菌生產(chǎn)的 napyradiomycins類新化合物及其制備方法和在制備抗菌抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0003] 近年來，發(fā)現(xiàn)新型海洋放線菌資源，并從中篩選新型的活性次生代謝產(chǎn)物成為國 際上海洋微生物研究的重要方向。從海洋放線菌中尋找結(jié)構(gòu)新穎、高效、低毒的代謝產(chǎn)物逐 漸成為藥物尋找的新源泉。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的第一個目的是提供一株海洋來源的鏈霉菌Streptomyces sp. SCSI0 10428,該菌于2013年5月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，地址：中國武漢 市武漢大學，其保藏編號為：CCTCC NO. Μ 2013186。
[0005] 本發(fā)明的海洋來源的鏈霉菌Streptomyces sp. SCSI0 10428是從廣西北海斜陽島 海域的海底沉積物中分離獲得的。常規(guī)方法提取其16S rRNA，其16S rRNA序列如SEQ ID NO. 1所示，將16S rRNA進行BLAST比對，并進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。 由此該菌株被鑒定為鏈霉菌Streptomyces sp.SCSIO 10428,該菌于2013年5月6日保藏 于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，地址：中國武漢市武漢大學，其保藏編號為：CCTCC NO. Μ 2013186〇
[0006] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)海洋來源的鏈霉菌Streptomyces sp. SCSI0 10428能夠產(chǎn)生多種 napyradiomycins類新抗生素化合物，包括4-dehydro_4a-dechloronapyradiomycin Al (1) ,3-dechlor〇-3-bromonapyradiomycin Al (2)和 3-chloro_6, 8_dihydroxy-8-a-lapacho ne (3)〇
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供三種新的具有抗菌和細胞毒活性的napyradiomycins 類抗生素 4-dehydro_4a-dechloronapyradiomycin Al (1), 3-dechloro_3-bromonapyradio mycin Al(2)和 3-chlor〇-6,8_dihydroxy-8-a -lapachone(3)，其結(jié)構(gòu)如式（I)所不：
[0008]
[0009] 當 Ri= Cl, R2= H，R3= No H，R4= geranyl 時為 4-dehydr〇-4a-dechloronapyra diomycin Al,
[0010] 當 Ri= Br，R 2= H 2, R3= Cl, R 4= geranyl 時為 3-dechlor〇-3-bromonapyradiom ycin Al,
[0011] 當札=Cl, R 2= H 2, R3= No H，R 4= No H 時為 3_chlor〇-6, 8-dihydroxy-8- α -1 apachone。
[0012] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種 4-dehydro_4a-dechloronapyradiomycin Al (1) ,3-dechlor〇-3-bromonapyradiomycin Al (2)和 3-chloro_6, 8_dihydroxy-8-a-lapacho ne (3)的制備方法。
[0013] 本發(fā)明的 4-dehydr〇-4a-dechloronapyradiomycin Al (1)，3-dechlor〇-3-brom onapyradiomycin Al(2)和 3-chlor〇-6,8-dihydroxy-8-a-lapachone(3)是從鏈霉菌 Streptomyces sp.SCSIO 10428的發(fā)酵培養(yǎng)物中制備分離得到的。
[0014] 本發(fā)明優(yōu)選通過以下方法從鏈霉菌Streptomyces sp. SCSI0 10428的發(fā)酵培養(yǎng)物 中制備得到 4-dehydro_4a-dechloronapyradiomycin A1 (1)，3-dechloro_3-bromonapyrad iomycin Al(2)和 3-chlor〇-6,8-dihydroxy-8-a-lapachone(3)，具體步驟如下：
[0015] (a)制備鏈霉菌 Streptomyces sp. SCSI0 10428 的發(fā)酵培養(yǎng)物；
[0016] (b)將發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵液和菌絲體分離，發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯 萃取液，濃縮后得到浸膏A ;菌絲體先用乙醇浸提，合并浸提液，回收乙醇后剩余水混合液 用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液濃縮后得到浸膏B，將浸膏A和浸膏B合并，得到粗提物；
[0017] (c)粗提物經(jīng)硅膠柱層析，異辛烷/乙酸乙酯v/v，30/1，16/1，8/1，4/1，2/1，1/1， 0/1 ;氯仿/甲醇ν/V，1/1，〇/1，梯度洗脫，收集異辛烷/乙酸乙酯體積比8/1洗脫的餾分 Fr. 3,收集異辛烷/乙酸乙酯體積比4/1洗脫的餾分Fr. 4,收集異辛烷/乙酸乙酯體積比 2/1洗脫的餾分Fr. 5 ;
[0018] (d)將餾分Fr. 3進行反相中壓液相層析，乙腈/水系統(tǒng)梯度洗脫，40/60,65/35， 80/20,82/18,84/16,86/14,93/17,96/14,100/0, v/v，依次得到 9 個餾分 Fr. 3A ~Fr. 31， 將餾分Fr.3I進行正相硅膠中壓液相層析，正己烷/乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫，98/2,96/4， 90/10, v/v，依次得到3個餾分Fr. 311~Fr. 313,將餾分Fr. 312進行凝膠柱層析，洗脫系統(tǒng) 為氯仿/甲醇體積比=1/1，然后對其第2個餾分Fr. 3122進行純化后得到化合物2 (3-dec hloro-3-bromonapyradiomycin Al)；
[0019] (e)將餾分Fr.5合并到餾分Fr.4中，將合并得到的餾分Fr.4進行反相中壓液 相層析，乙腈 / 水系統(tǒng)梯度洗脫，45/55, 50/50,60/40,64/36,66/34,68/32, 70/30, 75/25， 80/20,85/15,90/10,95/5,100/0, v/v，依次得到 13 個餾分 Fr. 4A ~Fr. 4M，將餾分 Fr. 41 合并到餾分Fr. 3G中，然后將合并后的Fr. 3G進行反相中壓液相層析，乙腈/水系統(tǒng)梯度洗 脫，60/40, 70/30, 70/30, 75/25,80/20,85/15,85/15,85/15,90/0, v/v，依次得到 9 個餾分 Fr. 3G1 ~Fr. 3G9,其中第 2 個飽分 Fr. 3G2 即為單體化合物 3 (3-chloro_6, 8_dihydroxy-8 -a -lapachone);將飽分Fr. 3G7 經(jīng)純化后得到化合物 1 (4-dehydr〇-4a-dechloronapyradi omycin Al) 〇
[0020] 所述的（a)步驟的制備鏈霉菌SCSIO 10428的發(fā)酵培養(yǎng)物優(yōu)選通過以下方法制 備：將活化的鏈霉菌Streptomyces sp. SCSI0 10428接入種子培養(yǎng)基中，28 °C，200rpm， 培養(yǎng)72h制得種子液，將種子液以體積百分比6 %的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C， 200rpm，振蕩培養(yǎng)7d，而制得發(fā)酵培養(yǎng)物，所述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為， 按質(zhì)量分數(shù)100 %計，包括可溶性淀粉1%，細菌學蛋白胨0.2%，酵母提取物0.4%， CaC030. l%，KBr 0. 01%，F(xiàn)e2(S04)3*4H20 0. 004%，海鹽 3%，余量為水，pH 7. 0。按上述 組份和含量混合均勻，然后121°C，滅菌30minD
[0021] 本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)化合物 4-dehydr〇-4a-dechloronapyradiomycin Al (1)，3_d echloro-3-bromonapyradiomycin Al (2)和 3-chlor〇-6, 8-dihydroxy-8-a -lapachone(3) 對金黃色葡萄球菌（S. aureus ATCC 29213)，枯草芽抱桿菌（B.Subtilis SCSIO BS01)和蘇 云金芽孢桿菌（B. thuringensis SCSIO BT01)等革蘭氏陽性菌具有較強的抑制作用（化合 物3對金黃色葡萄球菌S. aureus ATCC 29213除外）。其中，尤其是化合物2對這三種革蘭 氏陽性菌的MIC分別低至0. 5,1和1 μ g mL \比陽性對照所用的抗生素 ampici 11 in具有 更強的抑菌活性。同時，結(jié)果顯示化合物1-3對革蘭氏陰性菌的大腸桿菌（Escherichia coli ATCC 25922)沒有抑制作用。由此可見化合物 4-dehydro_4a-dechloronapyradiomyc in Al (1)，3-dechlor〇-3-bromonapyradiomycin Al (2)和 3-chlor〇-6, 8-dihydroxy-8-α - lapachone (3)具有較好抑制革蘭氏陽性細菌活性，有望研發(fā)成為抗菌新藥。
[0022] 因此本發(fā)明的第四個目的是提供 4-dehydro_4a-dechloronapyradiomycin Al (1) ,3-dechlor〇-3-bromonapyradiomycin Al (2)或 3-chlor〇-6, 8-dihydroxy-8-a -lapacho ne(3)