一種提高內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物中紫杉醇產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種提高內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物中紫杉醇產(chǎn)量的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫杉醇（Paclitaxel，商品名Taxol)是一種二砲類衍生物，是具有獨特抗癌機制 的天然產(chǎn)物，分子式為C 47H51NO14，最初從紅豆杉植物中分離得到。經(jīng)臨床驗證，具有良好的 抗腫瘤作用，特別是對癌癥發(fā)病率較高的卵巢癌、子宮癌和乳腺癌等有特效。紫杉醇是近年 來國際市場上最熱門的抗癌藥物之一。隨著地球人口癌發(fā)率的增長，對紫杉醇的需求量明 顯增大。目前臨床和科研所需的紫杉醇主要是從紅豆杉中直接提取。由于紫杉醇在植物體 中含量極低，生產(chǎn)Ikg紫杉醇需要2500棵左右成年紅豆杉樹木的原料，也因此造成了對紅 豆杉的大量砍伐，致使其天然資源趨于枯竭，造成了生物多樣性和生態(tài)環(huán)境的極大破壞。
[0003] 能合成紫杉醇的紅豆杉內(nèi)生真菌的發(fā)現(xiàn)，是紫杉醇資源研究的重要進展。自從 Stierle等證明短葉紅豆杉的內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生抗癌藥物紫杉醇，對植物內(nèi)生真菌的研究 更加引人注目。我國學(xué)者也發(fā)現(xiàn)了多種產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌。
[0004] 植物內(nèi)生菌是一種分布廣、種類多、生物學(xué)功能多樣的微生物資源庫。在與宿主植 物長期共進化過程中，內(nèi)生菌可產(chǎn)生一系列具有抗腫瘤、抗病毒、免疫抑制等作用的生物活 性。由于內(nèi)生真菌生長迅速，易于進行大規(guī)模培養(yǎng)，培養(yǎng)所需的原料可以是來源廣泛、價格 低廉的農(nóng)林副產(chǎn)物，因而利用內(nèi)生真菌生物制備紫杉醇，被認(rèn)為是破解紫杉醇來源的最有 效的解決方法。利用內(nèi)生真菌生物制備紫杉醇如：中國專利ZL200810152499. 2公開了一種 利用雙液相發(fā)酵提高真菌產(chǎn)紫杉醇的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)紫杉醇真菌擬盤多毛 孢（Pestalotiopsis microspora)NK17,當(dāng)菌體生長達到平臺期，加入有機溶劑繼續(xù)培養(yǎng)， 以使在所述菌株細胞內(nèi)和所述培養(yǎng)基中更多地產(chǎn)生和聚集紫杉醇，以及從所述細胞內(nèi)和培 養(yǎng)基中回收并提純紫杉醇。該方法紫杉醇產(chǎn)率可達551. 72 μ g/L。如能開發(fā)新的提高紫杉 醇產(chǎn)量的內(nèi)生真菌發(fā)酵方法，將有望為紫杉醇的制備提供新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種提高內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物中紫杉醇產(chǎn)量的方法，該方法周期短、 產(chǎn)率高，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，通過本發(fā)明特定的內(nèi)生真菌發(fā)酵及特定的工藝，同時在培養(yǎng)基中添 加具有協(xié)同增產(chǎn)效果的曼地亞紅豆杉和蜘蛛香，能夠有效地將其營養(yǎng)成分和有效成分進行 生物降解和轉(zhuǎn)化，使各原料資源得到充分的利用，有助于提高最終產(chǎn)品中紫杉醇的含量。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] -種提高內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物中紫杉醇產(chǎn)量的方法，包括步驟：
[0009] (1)取活化后的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌種接種到液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h-6h，離心 收集第一菌體；將第一菌體懸浮在含膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基中于20°C -30°C孵育3h-40h， 離心收集第二菌體；將第二菌體經(jīng)PBS緩沖液清洗干凈后重新懸浮于液體MRS培養(yǎng)基中，震 蕩搖勻，在20°C -30°C培養(yǎng)2天-10天，得到產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌種子液；
[0010] (2)將步驟（1)的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌種子液接入內(nèi)生真菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 16°C -30°C培養(yǎng)3天-30天，然后置于交變磁場環(huán)境中再培養(yǎng)5天-20天，培養(yǎng)產(chǎn)物經(jīng)真空 冷凍干燥、粉碎后得內(nèi)生真菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物；所述內(nèi)生真菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中含有曼地亞 紅豆杉和蜘蛛香；
[0011] (3)將步驟（1)的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌種子液接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)pH值為 3-7,在15°C -25°C培養(yǎng)5天-25天，離心，得到內(nèi)生真菌發(fā)酵終產(chǎn)物；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基 中含有內(nèi)生真菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物。
[0012] 本發(fā)明進行固態(tài)發(fā)酵時，直接采用經(jīng)含膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基孵育處理的產(chǎn)紫杉 醇內(nèi)生真菌種子液，同時在培養(yǎng)基中添加具有協(xié)同增產(chǎn)效果的蜘蛛香，能夠有效地將紅豆 杉中的營養(yǎng)成分和有效成分進行生物降解和轉(zhuǎn)化，有助于提高最終產(chǎn)品中紫杉醇的含量。 步驟（3)中，再次采用經(jīng)含膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基孵育處理的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌種子液對 含有內(nèi)生真菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行深層次發(fā)酵，使原料資源得到充分的利 用，進一步提高了最終產(chǎn)品中紫杉醇的含量。
[0013] 為了達到更好的效果，優(yōu)選：
[0014] 步驟⑴中，所述含膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基中膽鹽的質(zhì)量百分含量為 0· 1% -0· 5%〇
[0015] 所述第一菌體與用于懸浮第一菌體的含膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基的體積比為 1:1-3,第二菌體與用于懸浮第二菌體的液體MRS培養(yǎng)基的體積比為1:1-3。
[0016] 步驟（2)中，所述曼地亞紅豆杉可采用曼地亞紅豆杉的枝葉；所述蜘蛛香可采用 蜘蛛香枝葉。
[0017] 所述內(nèi)生真菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基每IL中含有2. Og-8. Og曼地亞紅豆杉和0. 5g-2. 5g 蜘蛛香。所述內(nèi)生真菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由曼地亞紅豆杉、蜘蛛香和發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成，所 述發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用本領(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可采用市售產(chǎn)品，也可采用現(xiàn)有配 制方法配制。
[0018] 所述內(nèi)生真菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，包括：將新鮮曼地亞紅豆杉、蜘蛛香在 自來水下沖洗干凈，晾干，切碎；再將2. Og-8. Og曼地亞紅豆杉和0. 5g-2. 5g蜘蛛香用發(fā)酵 基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容至1L，混合均勻，pH值自然，得到內(nèi)生真菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0019] 所述產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌種子液的接入量為內(nèi)生真菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基體積的 5% -25%〇
[0020] 目前產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌發(fā)酵技術(shù)普遍存在發(fā)酵周期長、菌絲生長萌發(fā)慢、特征次 生代謝產(chǎn)物含量低等問題。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將交變磁場處理技術(shù)應(yīng)用于固態(tài)發(fā)酵中，通過特定 培養(yǎng)時期的適當(dāng)處理等外界因素有效刺激，提高真菌菌絲在曼地亞紅豆杉和蜘蛛香培養(yǎng)基 料上的生長代謝，縮短發(fā)酵時間，有效促進次生代謝產(chǎn)物的生成。所述交變磁場環(huán)境中磁場 強度為0. 2mT-6mT，磁場頻率為3HZ-40HZ。
[0021] 步驟（3)中，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基每IL中含有0. 2g_lg內(nèi)生真菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物。 所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基由內(nèi)生真菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成，所述的發(fā)酵基礎(chǔ)培 養(yǎng)基采用本領(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可采用市售產(chǎn)品，也可采用現(xiàn)有配制方法配制。
[0022] 所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，包括：將0. 2g_lg內(nèi)生真菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物用發(fā) 酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容至1L，混合均勻，pH值自然，得到液體發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0023] -般發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：葡萄糖1% -3%、K2HPO4 0· 1% -0· 2%、MgS04 0· 05% -0· 1%和余量的水。
[0024] 所述產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌種子液的接入量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3% -20%。
[0025] 所述產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌種可采用現(xiàn)有任意一種產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌種，可采用 市售產(chǎn)品，例如：美麗鐮刀菌（Fusarium mairei)菌種，購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究 院。
[0026] 所述液體MRS培養(yǎng)基采用本領(lǐng)域常規(guī)的液體MRS培養(yǎng)基，可采用市售產(chǎn)品，也可采 用現(xiàn)有配制方法配制。一般液體MRS培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨10. 0g、牛肉浸膏10. 0g、酵 母浸膏5. 0g、葡萄糖20. 0g、乙酸鈉5. 0g、檸檬酸氫二銨2. 0g、吐溫-801. 0ml、磷酸氫二鉀 2. 0g、硫酸鎂0. 2g、硫酸錳0. 05g和蒸餾水1. 0升。
[0027] 所述PBS緩沖液即磷酸緩沖鹽溶液，采用本領(lǐng)域常規(guī)的PBS緩沖液，可采用市售 產(chǎn)品，也可采用現(xiàn)有配制方法配制。一般IL PBS緩沖液：磷酸二氫鉀0. 27g、磷酸氫二鈉 I. 42g、氯化鈉 Sg和氯化鉀0. 2g，加適量去離子水充分?jǐn)嚢枞芙猓缓蠹尤霛恹}酸調(diào)pH至 7. 2,最后定容到1L。
[0028] 所述活化后的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌種在液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的溫度均為自然 環(huán)境溫度，優(yōu)選為20°C -30°C。一般IL液體MRS培養(yǎng)基中接入lcm2-4cm2大小的活化后的 產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌種菌塊。所述產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌種的活化方法采用本領(lǐng)域常規(guī)的菌 種活化方法，包括：將斜面保藏的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進行活 化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20°C -30°C，培養(yǎng)時間3天-25天，得到活化后的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌種。 所述的PDA平板培養(yǎng)基采用本領(lǐng)域種子培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基，可采用市售產(chǎn)品。進一步優(yōu)選， 所述的PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g-20g，用水定容至1000mL。
[0029] 本發(fā)明所用的培養(yǎng)基均需滅菌后使用，滅菌的條件采用本領(lǐng)域