用于檢測(cè)埃博拉病毒的rpa試劑盒、其專用引物和探針及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及埃博拉病毒的分子生物學(xué)，特別涉及用于檢測(cè)埃 博拉病毒的RPA試劑盒及其專用引物和探針與其在檢測(cè)埃博拉病毒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 埃博拉病毒能引起一種在人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物中傳播的急性傳染病，稱之為埃博拉 出血熱。人感染埃博拉病毒后的潛伏期為3-21天，發(fā)病初期患者呈現(xiàn)出與一般流感相似的 高熱、頭痛等癥狀，隨后病情迅速進(jìn)展惡化，表現(xiàn)為出血、多器官衰竭及休克樣綜合癥。埃博 拉病毒屬于絲狀病毒科，包含5個(gè)亞型，其中四種可引起人類感染，致死率可高達(dá)90%。此 外，目前世界上還沒有針對(duì)埃博拉的有效的治療方法和疫苗。這使埃博拉病毒被歸為生物 安全四級(jí)病原微生物和A類生物威脅病原體，世界衛(wèi)生組織已將其列為對(duì)人類危害最嚴(yán)重 的傳染病之一。2014年，西非各國(guó)埃博拉病毒感染的疫情爆發(fā)，尤以塞拉利昂、利比里亞等 國(guó)甚為嚴(yán)重。因此，建立快速有效的埃博拉病毒的檢測(cè)方法對(duì)于埃博拉病毒感染的防控具 有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 目前，埃博拉病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷主要采用RT-PCR的核酸檢測(cè)方法。對(duì)于埃博拉病 毒的診斷來(lái)說(shuō)，RT-PCR方法雖然是一種敏感、特異的檢測(cè)方法，但是RT-PCR方法檢測(cè)所需 時(shí)間長(zhǎng)，在疫情現(xiàn)場(chǎng)無(wú)法使用。埃博拉疫情的暴發(fā)主要集中在非洲等貧困國(guó)家和地區(qū)，缺乏 健全的醫(yī)療保障體系，甚至連最基本的醫(yī)療資源都無(wú)法保障。而且RT-PCR檢測(cè)過(guò)程包括復(fù) 雜的核酸提取步驟，并且需要依賴特殊且價(jià)格昂貴的熱循環(huán)儀來(lái)完成擴(kuò)增過(guò)程，使其很難 在設(shè)備先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室之外進(jìn)行操作，且需要較長(zhǎng)時(shí)間才能得出結(jié)果，從而限制其應(yīng)用。因 此，急需建立一種快速又簡(jiǎn)便的埃博拉病毒現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法。
[0004] 近幾年中，若干恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)得到快速發(fā)展，如依賴于核酸序列的擴(kuò)增技 術(shù)（NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（RCA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP)和重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù) (RPA)等。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，核酸等溫?cái)U(kuò)增可以擺脫傳統(tǒng)的PCR儀，在短時(shí)間內(nèi)得到準(zhǔn) 確的檢測(cè)結(jié)果。然而，針對(duì)埃博拉病毒確定出適宜的方法，還需要技術(shù)人員做大量和深入的 研究，目前尚無(wú)明確可借鑒的思路和結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供用于檢測(cè)埃博拉病毒的RPA試劑盒、其專用引物及探針，以實(shí)現(xiàn)埃博 拉病毒的快速檢測(cè)。
[0006] 基于對(duì)多種恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的分析比較，確定本發(fā)明檢測(cè)埃博拉病毒以RPA技 術(shù)為基礎(chǔ)。重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA)是基于重 組酶聚合酶介導(dǎo)的擴(kuò)增原理，模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的酶反應(yīng)過(guò)程，依賴特定的酶和蛋白組合 (重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶）對(duì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，可在39 °C左右的恒溫條件下， 20分鐘內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)。對(duì)硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、食品安全、生物 安全等領(lǐng)域。由于不需要溫控設(shè)備，RPA可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測(cè)。而且RPA 還用不著復(fù)雜的樣品處理，適用于無(wú)法提取核酸的實(shí)地檢測(cè)。與其他核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相 比，RPA技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：RPA可以指數(shù)擴(kuò)增，并可設(shè)計(jì)序列特異性探針來(lái)實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增 產(chǎn)物，熒光信號(hào)可以通過(guò)便攜式掃描設(shè)備讀?。还押塑账嵩O(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，所需要的靶序列保守區(qū) 域與PCR引物及探針設(shè)計(jì)一致；RPA反應(yīng)試劑還可以干粉顆粒形式提供，方便保存運(yùn)輸及開 展現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
[0007] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供的用于檢測(cè)埃博拉病毒的RPA引物，所述引物是 根據(jù)埃博拉病毒NP基因保守序列設(shè)計(jì)的，用于埃博拉病毒的定性檢測(cè)；所述埃博拉病毒NP 基因保守序列是含有185個(gè)堿基的核苷酸片段，具有SEQ ID NO. :1所示的寡核苷酸序列。
[0008] 優(yōu)選地，所述引物包括正向引物（EB0-RPA-F2)和反向引物（EB0-RPA-R2)共兩條， 其序列分別如序列表中SEQ ID NO. :2和SEQ ID NO. :3所示。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用于檢測(cè)埃博拉病毒的探針，該探針是根據(jù)埃博拉病 毒NP基因保守序列設(shè)計(jì)的，用于埃博拉病毒的定性檢測(cè)；所述埃博拉病毒NP基因保守序列 是含有185個(gè)堿基的核苷酸片段，具有SEQ ID NO. :1所示的寡核苷酸序列。
[0010] 優(yōu)選地，所述探針的長(zhǎng)度為46~52bp，其中5'端至少30bp，3'端至少15bp。
[0011] 優(yōu)選地，所述探針由5'端序列、熒光基團(tuán)標(biāo)記的T、四氫呋喃（THF或叫dSPACER)、 淬滅基團(tuán)標(biāo)記的T、3'端序列及3'端封閉物幾部分組成。
[0012] 優(yōu)選地，所述探針具有SEQ ID NO. :4所示的寡核苷酸序列，且在探針中第32位的 核苷酸T和第33位的核苷酸T上分別標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，兩基團(tuán)之間有一個(gè)脫堿 基位點(diǎn)（THF)(修飾后的探針序列如表1的EB0-RPA-P)。當(dāng)其被核酸外切酶識(shí)別切割后，使 兩基團(tuán)分離而產(chǎn)生熒光信號(hào)。
[0013] 任何熒光基團(tuán)均可，常用的為FAM(羧基熒光素）或TAMRA(羧基四甲基羅丹明）； 淬滅基團(tuán)為BHQ (黑洞淬滅基團(tuán)）。常規(guī)熒光基團(tuán)優(yōu)選FAM，淬滅基團(tuán)優(yōu)選BHQl。
[0014] 更優(yōu)選地，所述探針可通過(guò)在探針3'端加適當(dāng)修飾基團(tuán)如：C3-間臂、磷酸基、生 物素-TEG或氨基來(lái)防止聚合酶催化的延伸反應(yīng)，使探針更穩(wěn)定。
[0015] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了用于埃博拉病毒快速檢測(cè)的RPA試劑盒，所述試劑 盒包括上述的RPA引物和探針。
[0016] 為了方便檢測(cè)，所述試劑盒還可以包括含有埃博拉病毒NP基因保守序列的陽(yáng)性 質(zhì)粒，所述陽(yáng)性質(zhì)粒含有如序列表中SEQ ID NO :1所示的埃博拉病毒NP基因保守序列。
[0017] 優(yōu)選地，所述試劑盒包括以下用于50 μ L的RPA反應(yīng)體系的試劑，所述試劑包括： 上述正向引物和反向引物各20pmol、上述探針5pmol。
[0018] 為了方便檢測(cè)，所述試劑盒也可以包括陰性對(duì)照、RPA檢測(cè)所需要的酶、緩沖液體 系和/或鎂離子，所述陰性對(duì)照為不含埃博拉病毒NP基因保守序列的RPA反應(yīng)體系。
[0019] 優(yōu)選地，50yL的RPA反應(yīng)體系如下：上述正、反向引物各2yL(10ymol/L)、上述 探針0. 5 μ L (10 μ mol/L)、DNA模板1 μ L、去離子水12. 5 μ L、緩沖液29. 5 μ L、醋酸鎂溶液 2. 5 μ L，加入含有凍干酶粉的0. 2mL反應(yīng)管。其中凍干酶粉來(lái)自TwistAmp exoRT試劑盒 (exo代表Exonuclease III。下同），以含有凍干酶粉的反應(yīng)管形式提供，緩沖液也由Twist 試劑盒直接提供；DNA模板濃度因所測(cè)樣品不同而不同。
[0020] 本發(fā)明還提供了上述引物、探針或試劑盒在埃博拉病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明所述的應(yīng)用，包括如下步驟：
[0022] (1)以待測(cè)樣品基因組DNA為模板，在所述引物的引導(dǎo)和所述探針標(biāo)記下進(jìn)行RPA 反應(yīng)；
[0023] (2)反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行結(jié)果判定：用RPA熒光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，曲線上升的樣本判定 為陽(yáng)性結(jié)果；曲線沒有上升的判定為陰性結(jié)果。
[0024] 優(yōu)選地，本發(fā)明所述的應(yīng)用，包括如下步驟：
[0025] ⑴擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備及加樣：將正反向引物各2yL(l〇ym〇l/L)、探針 0· 5 μ L(K) μmol/L)、樣本 1 μ L、無(wú) DNase 和 RNase 水 12. 5 μ L 和 29. 5 μ L 緩沖液到含有凍 干酶粉的〇. 2mL的TwistAmp RT exo反應(yīng)管中。然后將2. 5 μ L醋酸鎂溶液加到所有反應(yīng) 管中，稍混勻后立即放入RPA熒光檢測(cè)儀ESEQant Tube Scanner中進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
[0026] (2)擴(kuò)增：40°C擴(kuò)增20分鐘，每個(gè)20秒檢測(cè)一次FAM通道熒光，在反應(yīng)第4-5分 鐘，將反應(yīng)管取出充分混勻，之后放回?zé)晒鈾z測(cè)儀繼續(xù)檢測(cè)。